清溪乌鳖肽缓解小鼠白细胞减少能力的研究

摘 要：目的：探究清溪乌鳖肽缓解小鼠白细胞数目减少的能力。方法：将15只SPF级C57BL/6J雄性小鼠随机分为溶剂对照组，低剂量（2 mg·g-1）给药组和高剂量（4 mg·g-1）给药组，每组共5只，采用环磷酰胺腹腔注射干预21 d，构建白细胞减少小鼠模型，观察小鼠体重、主要器官病变状态、白细胞数目变化。结果：实验组和对照组小鼠之间体重没有显著差异；实验组和对照组小鼠之间主要脏器未见明显病变；以4 mg·g-1的剂量每日给小鼠灌胃清溪乌鳖肽，24 d后小鼠白细胞数目较对照组显著升高。结论：与对照组相比，给药组小鼠体重未见明显变化，未产生不良反应且主要器官未见明显病变，清溪乌鳖肽给药后有效缓解了小鼠白细胞数目的减少，并且这种效应呈现剂量依赖性。

关键词：清溪乌鳖；清溪乌鳖肽；白细胞减少

The Ability of Qingxi  Black Soft-Shelled Turtle Peptides to Alleviate Leukopenia in Mice

LI Chang1， WANG Yunjie2， ZHAO Xinyue1， WANG Jingjing2， BIAN Xiaohong1

（1.China Pharmaceutical University， Nanjing 211198， China; 2.Zhejiang Qingxi Turtle Industry Co.， Ltd.， Huzhou 313219， China）

Abstract： Objective： To explore the ability of Qingxi black soft-shelled turtle peptides （QXBSTPs） to alleviate the decrease in mice. Method： Fifteen SPF grade C57BL/6J male mice were randomly divided into a solvent control group， In the low-dose （2 mg·g-1） administration group， high-dose （4 mg·g-1） administration group， with 5 mice in each group， after 21 days of the intervention， cyclophosphamide was intraperitoneally injected to construct a leukopenia mouse model. The changes of mouse body weight， lesions in the major organs， and the number of leukocytes in the mice were observed. Result： There was no significant difference in body weight between the experimental and the control groups. There were no significant lesions in the major organs between the experimental and control groups. The leukocyte counts of the mice were significantly higher than those of the control group after 24 days of gavage of QXBSTPs at a dose of 4 mg·g-1 daily. Conclusion： Compared with the control group， no significant changes in body weight， no adverse effects and no significant lesions in major organs were observed in the administered group. The administration of QXBSTPs effectively alleviated the reduction of leukocyte number in the mice， and this effect showed a dose-dependent pattern.

Keywords： Qingxi black soft-shelled turtle; Qingxi black soft-shelled turtle peptides; leukocytopenia

中华鳖隶属于爬行纲龟鳖目鳖科鳖属，因其肉质鲜美，具有高蛋白、低脂肪酸的特性同时兼具药用保健价值[1-2]，已经成为我国重要的水产养殖品种。清溪乌鳖是从中华鳖野生体色变异个体中基于体色黑化特定选育出的中华鳖类品种（系）[3]，是经农业部审定的国家水产新品种，品种登记号为G S0l-003-2008[4-5]。

目前，与清溪乌鳖的相关研究有乌鳖的养殖技术[6-9]，包括饲料投喂、亲本选育、水质以及温室养殖[10]等内容；清溪乌鳖营养成分研究包括营养学方面，研究发现乌鳖中的黑色素具有较强的光稳定性与热稳定性，因其自身黑色素中含有稳定的自由基，可以吸收可见光和紫外光的辐射[11]；乌鳖黑色素还具有较强的抗氧化能力，能够提高人体免疫力，延缓衰老等功效[12]；乌鳖口服液具有明显的抗疲劳作用和对脑缺血具有保护作用[13]；乌鳖返春口服液用于卵巢低储备患者，对免疫降低引起的卵巢早衰有一定功效[14-15]。另有研究表明清溪花鳖可能通过降低血清中的炎症因子，来改善尿酸钠所导致痛风大鼠的病理变化[16]。清溪乌鳖肽是从清溪乌鳖中提取得到的蛋白水解产物，已有研究表明清溪乌鳖肽具有影响免疫力的作用[17]，从清溪乌鳖中获取的清溪乌鳖肽，还具有较高的药食价值，同时能够提供人体所需的维生素、氨基酸、脂肪酸等，对免疫细胞数目的提高也具有一定的效果[18]。本文通过检测清溪乌鳖肽对人体免疫细胞数目的影响，以探究清溪乌鳖肽缓解小鼠白细胞减少的能力。

环磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）是一种烷化剂类抗肿瘤药物，该药物在合适的浓度时能够在体内代谢产生酰胺氮芥，其具有干扰核酸复制和蛋白合成的作用。本文利用环磷酰胺能使血细胞数量下降，免疫细胞功能降低的副作用，来构建小鼠的白细胞减少模型[19]。通过对C57BL/6J小鼠进行腹腔注射，构建白细胞减少小鼠模型，用清溪乌鳖肽对小鼠进行灌胃治疗，通过监测小鼠外周血中白细胞数目来评估该供试品缓解白细胞减少的潜力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

清溪乌鳖肽，A公司（批号20230401）；环磷酰胺，上海阿拉丁；生理盐水（生产批号20220802），安徽靓水亭医疗器械有限公司。

1.2 仪器与设备

普通冰箱，TCL集团；SQP电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Vortex-Genie 2涡旋混合仪器，Scientific Industries；小鼠饲养笼具，郑州极硕科技有限公司；真空采血管，碧迪医疗器械（上海）有限公司；血细胞计数板，盐城市盐都区永康实验器材厂；载玻片，江苏世泰实验器材有限公司；血盖片，江苏世泰实验器材有限公司；ADVIA 2120全自动血液分析仪，西门子；吸管，广州洁特生物过滤股份有限公司。

1.3 实验动物

使用SPF级C57BL/6J雄鼠，将小鼠放于温度为20～26 ℃、湿度为40%～70%，12 h昼夜轮替的动物饲养房中进行适应性饲养3 d，鼠饲料为标准颗粒饲料。本实验所有C57BL/6J小鼠均由江苏华创信诺医药科技有限公司提供，生产许可证号：SCXK（苏）2020-0009。

1.4 实验方法

1.4.1 动物实验分组

将SPF级C57BL/6J雄性小鼠随机分为3组，每组共5只，其中溶剂对照组5只，注射10 mg·mL-1生理盐水溶液；低剂量给药组5只，注射现配的200 mg·mL-1清溪乌鳖肽溶液；高剂量给药组5只，注射现配的400 mg·mL-1清溪乌鳖肽溶液。

1.4.2 溶液制备

①供试品溶液。清溪乌鳖肽（批号20230401）淡黄色固体粉末，避光，密封于4 ℃保存。给药前临用临配，以生理盐水为溶剂，将清溪乌鳖肽配制成浓度为200 mg·mL-1、400 mg·mL-1的溶液。②环磷酰胺溶液。环磷酰胺，白色固体粉末，避光，密封于4 ℃保存。给药前临用临配，以生理盐水配制成10 mg·mL-1溶液。

1.4.3 模型构建

在0 d时，通过向小鼠腹腔注射环磷酰胺溶液（100 mg·kg-1）来建立白细胞减少的小鼠模型，在小鼠身上进行了为期21 d的预处理。随后分别按照体重以2 mg·g-1、4 mg·g-1的剂量将清溪乌鳖肽灌胃给给药组小鼠，对照组则灌胃等体积的生理盐水，给药按表1进行，每天1次。

1.4.4 白细胞计数

在24 d时，采用带有抗凝剂的真空采血管收集小鼠血液，利用全自动血液分析仪检测外周血白细胞总数。

1.4.5 指标采集

每天对处理后的小鼠进行体重检测，并用带有抗凝剂的离心管采集小鼠血液，检测小鼠白细胞数目。随后对小鼠进行安乐死，解剖观察小鼠主要脏器的颜色、大小、是否有病变情况等。

1.5 统计学方法

数据使用Graphpad Prism 9.0进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 小鼠体重检测结果分析

经清溪乌鳖肽灌胃24 d后，均未出现小鼠死亡情况，在同一时间段记录3组小鼠体重变化如图1所示。高剂量给药组（4 mg·g-1）与低剂量给药组（2 mg·g-1）的组间未见显著差异；各给药组与对照组之间均无显著差异（P＞0.05），各组小鼠整体上体重波动幅度接近。

2.2 小鼠解剖后脏器观察

3组小鼠解剖后脏器的变化情况见图2。结果发现，实验组与对照组小鼠的肺颜色、大小均无明显差异，未发现明显病变；心脏颜色、大小均无明显差异，未发现明显病变；肝脏颜色、大小均无明显差异，未发现明显病变；胃颜色、大小均无明显差异，未发现明显病变；肾脏颜色、大小均无明显差异，未发现明显病变；部分脾脏有颜色变化，但未发现明显病变。综上，说明清溪乌鳖肽没有对小鼠主要器官产生明显影响。

2.3 小鼠外周血中白细胞数目检测结果

使用带有抗凝剂的真空采血管收集小鼠血液，并对其中的白细胞数目进行检测。由图3可知，高剂量组的小鼠白细胞数目显著高于对照组的小鼠白细胞数目（P＜0.05），说明高剂量的清溪乌鳖肽具有缓解小鼠白细胞数目减少的能力。而低剂量组的小鼠白细胞数目与对照组相比则无显著差异。

3 结论与讨论

当前抗肿瘤药物、化疗等治疗手段大多为非特异性治疗手段，抗肿瘤的同时也会杀死正常细胞，降低人体的免疫力。SAKAI等[20]研究发现，随着患者年龄的增长，这种治疗方式造成的白细胞数目降低、免疫力降低等不良反应也会越发严重。环磷酰胺通过干扰癌细胞的DNA合成和修复来抑制其增殖而被广泛用于抗癌治疗，本实验利用环磷酰胺的毒副作用造成的外周血细胞减少，进而抑制正常免疫功能细胞数目，来构建白细胞数目减少模型[21]。配制清溪乌鳖肽溶液灌胃处理，来检测清溪乌鳖肽对小鼠白细胞数目减少的影响，具有一定的合理性。本研究发现，与对照组相比，清溪乌鳖肽（4 mg·g-1）

具有显著提高小鼠白细胞数目的能力，可在一定程度上缓解小鼠白细胞数目的减少。BERNADACH等[22]研究发现，化疗手段、抗肿瘤药物的使用会造成机体体重降低，腹泻、食管吞咽困难、呕吐等因素均与体重降低相关。心、肝、脾、肺、肾等器官在维持人体生命活动中发挥着重要作用，而化疗药物的使用会引起重要脏器毒性[23]。本研究发现清溪乌鳖肽对小鼠体重、主要脏器没有产生明显影响。