一步法固相萃取结合液相色谱-串联质谱法测定鲈鱼中孔雀石绿

摘 要：建立一种一步法固相萃取结合液相色谱-串联质谱法同时测定鲈鱼中孔雀石绿残留的分析方法。样品经乙腈和水盐析提取后，通过EMR-lipid净化，经Eclipse plus色谱柱分离后，在正离子模式（ESI+）下采集信号，以内标法定量。结果表明，孔雀石绿和隐色孔雀石绿的线性范围为0.1～2.0 ng·mL-1，相关系数r在0.999以上，定量限为0.04 μg·kg-1，加标回收率为93.6%～107.5%，相对标准偏差（n=6）为1.4%～4.0%。本方法经方法学验证，操作简单、准确度高，定量限满足限量要求，可为鲈鱼中孔雀石绿的定量分析提供参考。

关键词：鲈鱼；孔雀石绿；液相色谱-串联质谱法；一步法固相萃取

Abstract： A method for the determination of malachite green residues in bass fish by one step solid phase extraction combined with liquid chromatography tandem mass spectrometry. The sample was extracted by acetonitrile and water， after salting out， then cleaned up by solid phase extraction procedure using EMR-lipid. After chromatographic separation by Eclipse plus column， determination was accomplished in the positive ionization mode. Target substances were quantified by internal standard method. Through the protocol， the standard curve was linear in 0.1～2.0 ng·mL-1， linear correlation coefficients were above 0.999， limits of quantitation were 0.04 μg·kg-1. The recoveries ranged from 93.6% to 107.5%. Relative standard deviations （n=6） were in the range of 1.4% to 4.0%. This method has been verified for its simplicity and accuracy， and the limits of quantitation meets the limit requirements. It can provide a reference for the quantitative analysis of malachite green residues in bass fish.

Keywords： bass fish; malachite green; liquid chromatography tandem mass spectrometry; one step solid phase extraction

孔雀石绿是一种三苯甲烷类染料，可用来杀寄生虫和灭菌，早期被广泛运用在水产养殖行业。然而人们长期超量食用含孔雀石绿残留的食物容易致癌。根据我国农业农村部第250号公告的清单，孔雀石绿在食品动物中禁止使用。现市面上还没有其他特效药能在短时间内治愈水产养殖业中常见的水霉病，因此一些养殖户仍选择使用孔雀石绿，导致其超标率较高[1-2]。

目前，在我国日常食品安全监督抽检中，主要使用GB/T 19857—2005对水产品中的孔雀石绿进行检验，但实验操作中使用甲醇水体系提取，基质复杂，且中性氧化铝柱净化效果有限，造成检出限低的现象[3]。因此，急需建立一种灵敏度高且快速准确的测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

30份鲈鱼样品（购自本地农贸市场）；孔雀石绿、隐色孔雀石绿、孔雀石绿D5、隐色孔雀石绿D6标准溶液（1 000 μg·mL-1，美国First standard）；EMR-lipid固相萃取柱（500 mg/6 mL，美国Agilent）；乙腈（HPLC，德国Merck）；氯化钠（优级纯、上海沪试）；甲酸（HPLC，德国Merck）；0.2 μm针式滤器（亲水PTFE、美国Agilent）；水（由Millpore超纯水机制备）。

1.2 仪器与设备

液相色谱-串联质谱仪（日本Shimazu LC-30A+美国Sciex TripleQuad 4500）；涡旋振荡器（德国IKA MS3）；冷冻离心机（德国Sigma 2-16 KL）；全自动样品浓缩仪（瑞典Biotage TurboVap）；电子天平（瑞士梅特勒 XS205DU）。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

（1）提取。称取5 g试样（精确至0.01 g）置于50 mL聚丙烯离心管中，加入40 μL内标混合使用液（100 ng·mL-1），再加入5 mL水，涡旋振荡1 min，使样品均匀分散。再加入8 mL乙腈和3 g氯化钠，涡旋振荡1 min进行提取，于4 000 r·min-1下离心5 min。取4 mL上清液，加入1 mL水，混合均匀，待净化。

（2）净化。取待净化液直接过EMR-lipid固相萃取柱，让洗脱液随重力自然滴下，收集全部洗脱液，氮吹浓缩至1 mL以下，用水稀释至1 mL，涡旋10 s溶解残渣，过0.2 μm亲水性聚四氟乙烯（Polytetrafluoroethylene，PTFE）滤膜，上机分析。

1.3.2 标准溶液配制

分别精密移取孔雀石绿、隐色孔雀石绿及其内标标准溶液（1 000 μg·mL-1）1 mL，用乙腈稀释至100 mL，制成各自的标准储备液（10 μg·mL-1），-18 ℃避光条件下保存。再分别精密移取孔雀石绿、隐色孔雀石绿标准储备液（10 μg·mL-1）1 mL，用乙腈稀释至100 mL，制成外标混合使用液（100 ng·mL-1）。分别精密移取孔雀石绿D5、隐色孔雀石绿D6标准储备溶液（10 μg·mL-1）1 mL，用乙腈稀释至100 mL，制成内标混合使用液（100 ng·mL-1）。

精密移取外标混合使用液（100 ng·mL-1）10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、200 μL，再依次加入内标混合使用液（100 ng·mL-1）200 μL，用乙腈稀释至10 mL，相应稀释成外标浓度为0.1 ng·mL-1、0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1，内标浓度均为2 ng·mL-1的标准工作曲线溶液。

1.3.3 仪器条件

（1）色谱条件。色谱柱：安捷伦Eclipse plus（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流速：0.4 mL·min-1；进样体积：5 μL；柱温：40 ℃；流动相A：含0.1%甲酸水溶液；流动相B：乙腈；洗脱梯度：0～0.5 min，90%A；0.5～1.4 min，90%→10%A；1.40～1.41 min，10%A→90%A；1.41～2.00 min，90%A。

（2）质谱条件。电喷雾离子源（ESI+）；多反应离子监测；离子源温度：550 ℃；电喷雾电压：5 500 V；气流量（气帘气：30 psi；雾化气：55 psi；辅助加热气：55 psi）。质谱参数详见表1。

2 结果与分析

2.1 标准物质的离子色谱图

孔雀石绿、隐色孔雀石绿及2种内标物质的离子色谱图见图1。

2.2 前处理条件的优化

在提取阶段，在提取步骤中采用涡旋振荡取代了均质，避免重复使用均质刀头而产生交叉污染；提取溶剂使用乙腈和水的混合溶液，能有效地分散样品，提高提取效率，并添加了氯化钠，以增加水相的比重，使乙腈和水的混合溶液能有效分层，起到盐析的作用，获得纯乙腈上清液，有利于控制上柱溶液中乙腈水比例的稳定，也可以使大部分经水提取出的杂质留于水相中，减少后续净化过程的净化压力。

在净化阶段，与GB/T 19857—2005相比，采用了新型的EMR-lipid取代了传统的中性氧化铝作为固相萃取的填料，该填料属亲水亲脂型吸附材料，可直接上样，采用通过式吸附的净化原理，使固相萃取无需再经过活化平衡步骤，该法可实现“一步法净化”，在保证准确度和净化效果的同时，极大地缩短前处理时间[4]。

在过滤阶段，常用的滤膜材料有疏水性材料尼龙和亲水性材料聚醚砜。由于孔雀石绿和隐色孔雀石绿属于脂溶性染料，如使用尼龙，样品溶液水相比例较大，会加大过膜压力，过滤效果不理想，而且孔雀石绿极易被吸附于过滤的滤膜上，导致实验失败；亲水性材料聚醚砜在使用中也会对孔雀石绿有一定的吸附，降低检测的灵敏度。而PTFE惰性极强，与物质几乎不发生反应，能达到仅过滤颗粒物杂质的效果，因此是理想的过滤材料。故本文使用新型亲水PTFE滤膜取代了传统聚醚砜滤膜，最大程度保证孔雀石绿在过滤阶段不流失。

2.3 线性范围、定量限、回收率和精密度

标准工作曲线溶液上机分析后，以外标和内标的峰面积比值作为纵坐标，外标的浓度作为横坐标，绘制标准曲线，线性范围及相关系数见表2。

取空白样品5 g，添加外标混合使用液（100 ng·mL-1）2 μL，使得最终样品溶液浓度处于线性最低点（0.1 ng mL-1）。经测定，其信噪比（S/N）＞10，满足定量限要求，故以线性最低点处对应的样品含量0.04 μg·kg-1作为定量限。在加标回收实验中，选取1倍定量限、5倍定量限和10倍定量限3个浓度水平进行加标，每个浓度水平做6个平行样，结果均满足GB/T 27417—2017中关于方法确认的要求[5]。

2.4 实际样品测定

取本地农贸市场售卖的30份鲈鱼样品进行实际样品测试，其中检出2批次孔雀石绿和隐色孔雀石绿，该方法结果与GB/T 19857—2005方法的结果比较，两个方法间孔雀石绿和隐色孔雀石绿结果的绝对差值占算数平均值的百分比分别为5.6%～8.6%和4.9%～9.5%。取中国检验检疫科学研究院提供的鱼肉质控样进行测试，本方法孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的测定结果|Z|值为0.6，满足测量值范围|Z|值≤2的要求。

3 结论

本文以常见的鲈鱼为分析样本，建立了以孔雀石绿为分析目标物的检测方法。该方法使用新型填料取代传统填料，准确度高，重复性好，实验速度快，定量限等指标均满足现行标准的检测要求。在食品安全检验中，可提供筛查鲈鱼中违法添加孔雀石绿的检测技术手段。

参考文献

[1]福建省疾病预防控制中心.孔雀石绿的危害，了解一下[EB/OL].（2020-09-08）[2023-06-09].http：//www.fjcdc.com.cn/show？ctlgid=152616&Id=17572.

[2]中华人民共和国农业农村部.中华人民共和国农业农村部公告 第250号[EB/OL].（2019-12-27）[2023-06-09].http：//www.moa.gov.cn/govpublic/xmsyj/202001/t20200106_6334375.htm.

[3]中华人民共和国国家质量监督检验检验总局，中国国家标准化管理委员会.水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定：GB/T 19857—2005[S].北京：中国标准出版社，2005.

[4]陈小华，汪群杰.固相萃取技术与应用[M].北京：科学出版社，2010.

[5]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.合格评定 化学分析方法确认和验证指南：GB/T 27417—2017[S].北京：中国标准出版社，2017.