拮抗猕猴桃腐败菌酵母的分离与鉴定

基金项目：贵州省教育厅特色领域项目（黔教合KY字（2021）062）。

作者简介：刘昂（2000—），女，山东菏泽人，硕士在读。研究方向：微生物药学。

通信作者：朱德全（1980—），男，贵州遵义人，博士，副教授。研究方向：微生物与发酵工程。E-mail：zdqoliver

@163.com。

摘 要：猕猴桃具有丰富的维生素和生物活性物质，具有较高的食用和药用价值。然而，由于其皮薄多汁，猕猴桃采摘后容易腐败。研究表明，导致猕猴桃腐败的主要病原菌是葡萄坐腔菌（Botryosphaeria dothidea）和间座壳菌（Diaporthe phaseolorum），其次是灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。酵母菌是较好的果蔬采后生防菌，对引起果蔬采后病害的病原菌具有很好的拮抗作用。本研究从传统发酵食品和水果表面分离纯化酵母菌株，并以灰葡萄孢菌和葡萄坐腔菌为指示菌，采用平板对峙法筛选出对这两种菌具有抑菌活性的酵母菌菌株。一共分离纯化了19株酵母菌，筛选出5株对灰葡萄孢菌和葡萄坐腔菌具有良好抑菌活性的酵母，分别为YMF-a、PJ1、SC、MG、JJ。其中，酵母菌YMF-a表现出最显著的拮抗效果，对葡萄坐腔菌和灰葡萄孢菌的抑制率均超过60%。通过菌体和菌落形态及26S rDNA序列分析鉴定，鉴定YMF-a、PJ1、SC、MG、JJ为文莱毕赤酵母（Pichia bruneiensis）、季也蒙迈耶氏酵母（Meyerozyma guilliermondii）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）、文莱毕赤酵母（Pichia bruneiensis）和膜醭毕赤酵母（Pichia membranifaciens）。本研究筛选和分离的拮抗酵母为开发猕猴桃的生物保鲜剂奠定基础。

关键词：猕猴桃；筛选鉴定；拮抗酵母；生物防治

Screening and Identification of Antagonistic Yeast of Kiwi Spoilage

LIU Ang1，2， ZHANG Yujie1，2， DONG Boyu1，2， YAO Qiuping1，2， FENG Yao1，2， ZHU Dequan1，2*

（1.School of Ethnic-Minority Medicine， Guizhou Minzu University， Guiyang 550025， China;

2.Key Laboratory of Guizhou Ethnic Medicine Resource Development and Utilization， Guizhou Minzu University， State Ethnic Affairs Commission， Guiyang 550025， China）

Abstract： Kiwifruit is known for its abundant vitamins and bioactive substances， and has high edible and medicinal value. However， due to its thin and juicy skin， it is prone to decay after harvesting. Studies have shown that the main pathogens causing kiwifruit decay are Botryosphaeria dothidea and Diaporthe phaseolorum， followed by Botrytis cinerea. Yeast is an excellent post-harvest biocontrol agent for fruits and vegetables， with good antagonistic effects on pathogenic microorganisms that cause post-harvest diseases. In this study， yeast strains were isolated and purified from traditional fermented foods and fruit surfaces， and using Botrytis cinerea and Botryosphaeria dothidea as indicator bacteria， and yeast strains with antibacterial activity against Botrytis cinerea and Botryosphaeria dothidea were screened using a plate confrontation method. A total of 19 yeast strains were isolated and purified， and 5 yeast strains with good inhibitory activity against Botrytis cinerea and Botryosphaeria dothidea were selected， namely YMF-a， PJ1， SC， MG， and JJ. Among them， the yeast strain YMF-a showed the most significant antagonistic effect， with inhibition rates against both Botrytis cinerea and Botryosphaeria dothidea exceeding 60%. Through morphological and 26S rDNA sequence analysis， YMF-a， PJ1， SC， MG， and JJ were identified as Pichia bruneiensis， Meyerozyma guilliermondii， Candida tropicalis， Pichia bruneiensis， and Pichia membranifaciens， respectively. The screening and isolation of antagonistic yeast in this study lay the foundation for the development of biological preservation agents for kiwifruit.

Keywords： Kiwi; screening and identification; antagonizes yeast; biocontrol

猕猴桃又称奇异果、狐狸桃等，属于双子叶植物的猕猴桃科（Actinidiaceae）猕猴桃属（Actinidia）[1]。猕猴桃属为呼吸跃变型果实，采后容易腐烂软化。在果实生长后期至储运期，常发生猕猴桃软腐病，是影响采后贮藏品质的主要真菌性病害之一，也是导致采后贮运损失的重要因素之一[2]。研究表明，引起猕猴桃腐烂的致腐微生物主要为真菌。李诚等[3]从江西省奉新县猕猴桃中分离鉴定出葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、拟茎点霉菌（Phomopsis sp.）为主要病原菌。雷霁卿等[4]和潘慧等[5]通过调查研究红阳猕猴桃病果，发现导致软腐病的病原菌主要有葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、拟茎点霉菌（Phomopsis sp.）、间座壳菌（Diaporthe sp.）和链格孢菌（Alternaria alternata）等。石浩[6]在软枣猕猴桃中分离鉴定出子囊菌门中主要的优势病原菌为葡萄座腔菌属（Botryosphaeia dothidea）和间座壳菌属（Diaporthe phaseolorum）。杨帅[7]认为猕猴桃中主要的优势病原菌为灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），该菌严重威胁果蔬产量和品质安全。

酵母是指一类可以发酵糖类物质的真核微生物，广泛存在于果实表面、叶片、根部、土壤和海水等环境中。拮抗酵母可通过体外和体内方法进行拮抗菌的筛选与分离[8-9]。大量研究表明，酵母具有很高的拮抗潜力。DA等[10]利用体内和体外筛选方法，从土壤、树叶、花朵和柑橘类水果中分离出对意大利青霉菌具有很高预防和治疗应用潜力的酵母。IGNATOVA等[11]从豆科植物下收集的深色栗子土壤中筛选出了10种可以抑制植物病原真菌生长发育的酵母菌株。朱寒冰等[12]从191株酵母中筛选出17种对腐败菌具有拮抗作用的酵母菌。范先敏[13]通过筛选发现了

5株对猕猴桃软腐病菌生长具有抑制作用的生防菌株。郭虹娜[14]研究发现拮抗酵母挥发物可以抑制灰葡萄孢菌的菌丝生长。

本研究旨在通过体外拮抗实验筛选出具有拮抗猕猴桃腐败菌潜力的酵母菌株，并结合菌株形态特征观察和分子生物学方法进行鉴定。希望为猕猴桃的生物保鲜提供支持，并为开发猕猴桃贮藏保鲜的酵母生防制剂提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

（1）供试病原菌：灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）和葡萄坐腔菌（Botryosphaeria dothidea），购于菌种保藏中心。

（2）酵母菌：从醪糟、酸菜、炸肉、泡椒、糟辣椒、玉米面粉发酵面团等各种发酵食品和水果店采购的苹果、草莓、金桔、雪梨、芒果、紫提子等水果以及番茄、南瓜等表面分离酵母菌。

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato Dextrose Agar，PDA）、马铃薯葡萄糖肉汤（Potato Dextrose Broth，PDB）、麦芽汁琼脂培养基、麦芽汁培养基，上海博微生物科技有限公司。

1.1.3 仪器与设备

电热恒温培养箱（DH6000BII），天津市泰斯特仪器有限公司；洁净工作台（SW－CJ－2FD），苏州安泰空气技术有限公司；生物显微镜（Motic BA200），重庆奥普光电技术有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅（LDZX－50KE），上海申安医疗器械厂；高速冷冻离心机（X1R），赛默飞世尔科技（中国）有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DH－101－2AB），天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酵母菌分离

将醪糟、酸菜、炸肉、两种泡椒、糟辣椒、玉米面粉发酵面团和自然发酵的雪梨、紫提子、芒果、苹果、番茄、南瓜、金桔、草莓、青提表皮分别取一点放入小烧杯中，经无菌水浸泡后在麦芽汁琼脂培养基上涂布，28 ℃条件下培养2～3 d。随后，分离纯化以获得酵母菌，并编号为LZ-A、LZ-B、SC、ZR、PJ1、PJ2、ZLJ、YMF-a、YMF-b、XL、TZ、MG、PG、FQ、NG、JJ、CM。

1.2.2 酵母菌保藏

将纯化好的酵母菌接种于PDB培养基中培养3～5 d，并且传2～3代，传好代后的菌液振荡、离心，菌体附着在离心管底部，倒掉上清液，加入含30%甘油的麦芽汁培养基，将菌液振荡均匀放置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 腐败菌活化

将病原菌菌块接种到新的PDA培养基上，使菌丝面与培养基紧密接触，放入预设温度为28 ℃的恒温培养箱培养5～7 d，备用。

1.3 病原菌形态特征观察

将分离纯化后的病原菌菌株转移至PDA平板，菌株1呈淡淡的淡褐色，菌丝密集，生长蔓延至培养基边缘；菌丝有隔膜，呈分枝状，附着有孢子，符合灰葡萄孢菌性状，见图1。菌株2的菌丝生长稠密，且菌丝生长初期为白色棉絮状，后期为浅灰色或灰黑色的菌丝，并且向平板边缘蔓延生长；菌丝有隔膜，产生分支，培养10 d后产生孢子，符合葡萄坐腔菌性状，见图2。

1.4 拮抗酵母菌的筛选与鉴定

1.4.1 拮抗酵母菌的初筛

利用平板对峙法，将培养5～7 d的灰葡萄孢菌和葡萄坐腔菌分别置于PDA培养基上，在PDA平板的中央接种直径为6 mm的病原菌菌饼，并距离该菌饼2 cm处接种同等直径的酵母菌菌块，在平板底部划线将培养基均匀划分成4块，按照上述操作方法将4种不同来源的酵母接种于培养基上，菌面朝下让酵母菌与培养基紧密接触。操作完成后用封口膜密封平板，28 ℃恒温培养箱培养3～5 d。再对腐败菌有抑制效果的酵母菌进行进一步筛选。