饮用水中铜绿假单胞菌快速检测的研究进展

基金项目：浙江省市场监督管理局科研计划资助项目（ZC2021B077）。

作者简介：丁言炎（1972—），男，浙江湖州人，本科，工程师。研究方向：食品安全检验检测。

通信作者：沈敏炬（1981—），男，浙江湖州人，本科，主管药师。研究方向：食品安全检验检测。E-mail： shenminju@163.com。

摘 要：铜绿假单胞菌是一种条件致病菌，广泛存在于各类水体环境中，对消毒剂、紫外线等因素具有很强的抵抗力，可引起急性肠道炎等各种疾病。本文主要阐述了5种饮用水中铜绿假单胞菌快速检测技术的优点和具体应用，可为饮用水中铜绿假单胞菌的检验检测和质量控制工作提供参考。

关键词：铜绿假单胞菌；快速检测；饮用水

Research Progress of Rapid Detection of Pseudomonas aeruginosa in Drinking Water

DING Yanyan1， ZHANG Xiaohong2， ZHENG Lianbao1， SHEN Minju1*

（1.Deqing Food and Drug Inspection and Testing Center， Huzhou 313200， China; 2.Lishui Institute for Quality Inspection and Testing， Lishui 323000， China）

Abstract： Pseudomonas aeruginosa is a opportunistic pathogen that widely exists in various water environments. It has strong resistance to disinfectants， ultraviolet rays， and other factors， and can cause various diseases such as acute enteritis. This paper mainly expounds the advantages and specific applications of rapid detection technology of Pseudomonas aeruginosa in five kinds of drinking water， which can provide reference for the detection and quality control of Pseudomonas aeruginosa in drinking water.

Keywords： Pseudomonas aeruginosa; rapid detection; drinking water

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）又称绿脓杆菌，是一种常见的水源性致病菌，广泛存在于各类水体中，对消毒剂、紫外线等理化因素具有很强的抵抗力，可引起败血症、脑膜炎和急性肠道炎等疾病。世界卫生组织的食品安全评估明确指出，铜绿假单胞菌是婴儿瓶装饮用水的危害指示菌[1]。

随着全球饮用水消费量的不断增加，有关饮用水中铜绿假单胞菌污染的报道屡见不鲜，饮用水食品安全问题日益引起了人们的关注[2-7]。世界卫生组织明确指出，与饮用水有关的安全问题大多来自微生物污染[8]。2019年初，《消费者报道》整理了2014—2018年国家及省级市场监督管理局关于桶装水的质量抽检情况，共检出2 350批次不合格的桶装水，其中铜绿假单胞菌检出高达1 551次，占比66%。显然，铜绿假单胞菌污染是影响桶装饮用水质量安全的最主要问题，也是长期困扰生产企业质量控制技术的难题[9-11]。

2015年，《食品安全国家标准 包装饮用水》

（GB 19298—2014）将铜绿假单胞菌作为各类包装饮用水质量检测指标之一。《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》（GB 8538—2022）是国内饮用水中铜绿假单胞菌项目检测的“金标准”，但该方法检测实验次数多、操作复杂、耗时长，难以快速检测样品。因此，国内外研究者们正致力于研究和开发一种简单、快速、准确的铜绿假单胞菌检测技术。近年来，随着信息生物学、分子生物学技术的快速发展，聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）、定量PCR、多重PCR及环介导等温扩增技术等凭借简便省时、特异性强、灵敏度高等优点，被广泛应用于饮用水中铜绿假单胞菌的检验检测和研究。

1 铜绿假单胞菌的快速检测技术

1.1 基于多重荧光定量PCR技术快速检测

荧光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）方法，基于常规PCR和荧光标记技术的先进分子生物学手段，具有用时短、灵敏度高、特异性强等优点[12]，已被广泛应用于食源性致病菌的检测。龙慧等[13]以uidA和gyrB基因作为引物和探针，建立能同时检测铜绿假单胞菌和大肠埃希氏菌的多重荧光定量PCR体系，该法检测时间短，可在2 h内完成PCR扩

增；灵敏度高，两菌的检测限均为102 CFU·mL-1；特异性强，能准确识别各类非目标菌，且引物与探针间无交叉扩增；铜绿假单胞菌加标回收率大于70%。在一定程度上弥补了饮用水中铜绿假单胞菌和大肠埃希氏菌传统检测方法的缺陷，加快了饮用水食品质量安全建设。

1.2 实时荧光环介导等温扩增检测

聚合酶链式反应可利用引物，在酶的作用下，短时间内完成核酸信号扩大。相比常规的PCR技术，新型荧光定量PCR技术则通过带荧光的探针，实现实时荧光定量检测。实时荧光环介导等温扩增检测是一种实时荧光与环介导等温扩增相结合的检测方法。曾思思等[14]利用铜绿假单胞菌的外毒素A基因（Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A，PEA）序列，设计LAMP引物，开发出一款快速、灵敏、操作简便的实时荧光环介导等温扩增检测铜绿假单胞菌的方法，该方法特异性强，且与其他菌株不存在交叉反应，检出限可达5.2 CFU·mL-1。

1.3 基于聚合酶螺旋反应的铜绿假单胞菌检测技术

聚合酶螺旋反应（Polymerase Spiral Reaction，PSR）是一种利用混合引物，以Bst DNA聚合酶的链置换活性及其扩增为体系，通过引物结合—延伸—解链—单链旋转及再次延伸的循环，在等温条件下，实现扩增核酸的恒温扩增技术。PSR法兼具LAMP法和PCR法的优点，如引物设计简单、只需一种酶、反应高效等。与PCR法相比，该方法能在恒温条件下完成核酸扩增反应，无须电泳步骤，敏感性高，可实时检测。朱渊等[15]利用铜绿假单胞菌外毒素A调控基因-ETA基因（toxA）设计引物，通过加入加速引物、选择合适颜色指示剂和优化反应条件，建立PSR快速检测铜绿假单胞菌的方法。可视化的PSR方法为铜绿假单胞菌快检提供了一种可行有效的新技术，该方法在65 ℃等温条件下，在40 min内可完成PSR反应步骤，且能利用钙黄绿素和羟基萘酚蓝反应产生的色差直接判读结果。与传统检测方法相比，PSR方法灵敏度高，可视化效果好，且最低检出限为20 CFU·mL-1。

1.4 基于重组酶介导等温扩增法检测铜绿假单胞菌

重组酶介导等温扩增（Recombinase-Aided Amplification，RAA）是一种利用3种酶（重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶）在等温件下进行核酸扩增的技术。与传统PCR方法及其他等温扩增技术相比，其优势是检测速度快、操作简便，且设备体积小，便于携带，适用于现场快速检测和基层实验室。

姚丽锋等[16]通过对铜绿假单胞菌lasB基因的特异性保守区域进行分析，设计特异性引物和探针，优化组合，构建铜绿假单胞菌实时荧光RAA检测方法，该方法特异性强（只对铜绿假单胞菌有扩增曲线，对其他细菌无交叉反应）、灵敏度高（纯菌检测灵敏度为1.7 pg·μL-1）、反应时间短（仅需20 min），适合于食品中铜绿假单胞菌的快速检测。

1.5 环介导等温扩增技术检测铜绿假单胞菌

环介导等温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一种基于核酸扩增的技术，相对于传统PCR，该技术反应快、灵敏性高、特异性强。其原理为当反应温度为60～65 ℃时，DNA双链解开，在Bst DNA聚合酶的作用下，不断地重复循环，整个过程包括循环模板合成、扩增循环、伸长再循环3个阶段。DNA扩增过程中会产生大量的焦磷酸根离子，与体系中的镁离子结合产生焦磷酸镁沉淀，可通过颜色差异观察结果。

曹科峰等[17]利用铜绿假单胞菌gbca基因，通过设计3对特殊的LAMP引物，同时在体系中加入荧光染料-羟基萘酚蓝，通过反应色差观察结果，并以电泳加以验证，建立了一种简单、快速的基于色差变化判定结果的LAMP检测铜绿假单胞菌的方法，其灵敏性优于PCR法检测。该方法在包装水、食品、化妆品等领域均有较好的运用[18-20]。

2 结语

在食品检验领域，简单、即时、快速和准确地完成检验检测，是研究学者追求的目标。本文主要综述了5种饮用水中铜绿假单胞菌的快速检测方法。随着新技术、新仪器不断涌现，各种检验技术也不断更新，且相关学者在不断探索创新其他技术和方法，以期铜绿假单胞菌的检验不再受时间、地点、操作等条件的限制，实现快速、高效、准确检测，保障人们饮用水质量安全。

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