富源酸菜源乳酸菌分离鉴定及益生特性研究

摘 要：目的：从自然发酵富源酸菜中分离乳酸菌，研究其益生特性，为乳酸菌益生菌制剂研发提供基础数据。方法：采集自然发酵的富源酸菜样品，使用MRS培养基分离乳酸菌，研究其耐酸、耐胆盐、抑菌活性和抗生素敏感性等益生特性，并采用16S rDNA基因序列分析法进行鉴定。结果：分离得到MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2 4株菌株，16S rDNA序列分析结果表明，MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2分别为植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、德氏乳杆菌和发酵乳杆菌;与参考菌株鼠李糖乳杆菌LGG相比，戊糖乳杆菌MH-4和德氏乳杆菌ZY-3具有较强的耐受性和抑菌活性;抗生素敏感性试验结果显示，戊糖乳杆菌MH-4对氯霉素、红霉素中度敏感，德氏乳杆菌ZY-3对氯霉素敏感、对红霉素中度敏感。结论：从富源酸菜中分离得到植物乳杆菌、戊糖乳杆菌、德氏乳杆菌和发酵乳杆菌4株乳酸菌，戊糖乳杆菌MH-4和德氏乳杆菌ZY-3具有显著耐受性、抑菌活性和抗生素敏感性等益生特性，可作为微生态制剂候选菌株开展深层次研究。

关键词：富源酸菜;乳酸菌;益生特性;抑菌活性;抗生素敏感性

Isolation， Identification and Probiotic Properties of Lactic Acid Bacteria from Fuyuan Sauerkraut

YE Pengfei， LIU Jing， LI Qiuda ， ZHOU Jie， HUANG Jieqiu， DU Yanqiong

（Department of Modern Agriculture， Qujing Vocational and Technical College， Qujing 655000， China）

Abstract： Objective： To provide basic data for the research and development of lactic acid bacteria probiotic preparations by isolating lactic acid bacteria from natural fermented Fuyuan sauerkraut and then studying its probiotic properties. Methods： MRS medium was used to isolate suspected lactic acid bacteria from samples of Fuyuan sauerkraut to study its probiotic properties， such as acid resistance， bile resistance， antibacterial activity and antibiotic sensitivity. And  16SrDNA sequence analysis was also applied to identify the lactic acid bacteria above. Results： Four strains， MH-3， MH-4， ZY-3 and YS-2， were isolated. According to 16S rDNA sequence analysis， MH-3， MH-4， ZY-3 and YS-2 were identified as Lactobacillus plantarum， Lactiplantibacillus pentosus， Lactobacillus delbrueckii and Lactobacillus fermentum， respectively. Compared to the reference strain Lactobacillus rhamnosus LGG， both

L. pentosus MH-4 and L. delbrueckii ZY-3 showed greater tolerance and higher antimicrobial activity. Test results of antibiotic sensitivity showed that L. pentosus MH-4 was moderately sensitive to chloramphenicol and erythromycin， and L.delbrueckii ZY-3 was sensitive to chloramphenicol and moderately sensitive to erythromycin. Conclusion： Four LAB strains， Lactobacillus plantarum， Lactiplantibacillus pentosus， Lactobacillus delbrueckii and Lactobacillus fermentum were isolated from Fuyuan sauerkraut. Among them， L. pentosus MH-4 and  L. delbrueckii ZY-3， with better performance in probiotic properties， like tolerance， antimicrobial activity and antibiotic sensitivity， were proved to be candidates for further in-depth research for microecological preparations.

Keywords： Fuyuan sauerkraut; lactic acid bacteria; probiotic properties; antibacterial activity; antibiotic sensitivity

富源酸菜是云南省富源县农村常见的一种酸菜，以萝卜、新鲜青菜、玉米面和水为原料，不添加其他原料，经自然发酵等工艺制成的食品[1]。富源酸菜富含膳食纤维、钙、磷、铁和硒等营养物质，具有健胃消食、减肥消暑、醒酒去腻等功效，因其特有的风味受到人们的喜爱。2016年12月，富源酸菜协会成功将富源酸菜和富源酸菜猪脚火锅制作技艺申报列为曲靖市非物质文化遗产保护名录。富源酸菜生产主要以家庭小作坊式为主，发酵过程大部分是在开放的环境中进行的，参与自然发酵的微生物种类较多。目前，关于富源酸菜有益微生物资源的分离、鉴定及相关研究尚未见文献报道。本研究从富源酸菜中分离鉴定乳酸菌并进行益生特性研究，为挖掘、利用微生物资源，提升传统发酵食品营养及功能品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

样品采自云南省富源县传统自然发酵酸菜。

1.1.2 指示菌和参考菌株

大肠杆菌（Escherichia coli）CMCC44102、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）CMCC（B）50041、福氏志贺氏菌（Shigella flexneri），上海保藏生物技术中心;鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）LGG由本实验室保存。

1.1.3 试剂与仪器

MRS肉汤及琼脂培养基、维生素C、石蜡油、胆盐，索莱宝生物科技有限公司;革兰氏染色剂，南京建成科技有限公司;厌氧产气袋，MGC日本三菱有限公司;标准药敏片，常德比克曼生物科技有限公司。

高压灭菌锅YX-18L-M，江阴滨江医疗设备有限公司;超纯水仪，美国MILLIPORE公司;超低温冰箱，ULT1386-3-V41 Thermo;涡旋混合器，江苏海门市麒麟医用仪器厂;微波炉M3-L236E金色，广东美的厨房电器制造有限公司;单人单面净化工作台CJ-2D、生化培养箱SPX-70BⅢ，天津市泰斯特仪器有限公司;电子天平214A，上海豪晟科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集

参照罗强等[2]方法，采集云南省富源县农家天然发酵酸菜样品，用无菌移液器吸取混合均匀的酸菜汁液快速装入30%的无菌甘油管中，置于采样箱中，冰浴状态下带回实验室，-80 ℃保存备用。

1.2.2 乳酸菌分离

将保存于30%甘油中的样品进行10倍梯度稀释，按1%比例接种到添加0.1%抗坏血酸的MRS肉汤中，37 ℃厌氧条件下培养24 h，富集后将培养液梯度稀释接种于1%碳酸钙-MRS琼脂培养基上，37 ℃厌氧培养48 h，挑取菌落形态不同，并有明显溶钙圈的单菌落，纯化3次后保存备用[3]。

1.2.3 乳酸菌鉴定

（1）革兰氏染色、接触酶试验。将分离得到的菌株分别进行革兰氏染色试验、接触酶测定试验鉴定。

（2）分子生物学鉴定。分离得到的4株疑似菌株委托安徽通用生物科技有限公司进行16S rDNA测序，测定序列后分析比对并通过clustalX 2.0和Mega 4.0软件构建系统发育树对分离得到菌株进行鉴定[4]。

1.2.4 益生特性研究

（1）耐受性试验。①酸耐受试验。参照许强等[5]方法，接种单菌落于10 mL MRS肉汤培养基中，37 ℃厌氧培养16 h，按5%比例接种到pH=2.0和pH=3.0的MRS液体培养基中，在pH=2.0的条件下孵育1 h，在pH=3.0的条件下孵育3 h，用平板计数计算乳酸菌菌落数，并与参考菌株鼠李糖乳杆菌LGG比较。②胆盐耐受试验。接种单菌落于10 mL MRS肉汤培养基中，37 ℃厌氧培养16 h，按5%比例接种于不同胆盐水平（0.1%和0.3%）的MRS肉汤培养基中，37 ℃培养24 h，用平板计数计算乳酸菌菌落数，并与参考菌株鼠李糖乳杆菌LGG比较。

（2）对主要肠道致病菌的抑菌作用。参照邹建华等[6]采用琼脂打孔扩散法研究菌株的培养上清液（pH值调整至6.2）对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和福氏志贺氏菌的抑制作用，并与参考菌株鼠李糖乳杆菌LGG比较。

（3）抗生素敏感性试验。参照邹建华等[6]采用滤纸片扩散法，分析4株乳酸菌的抗生素敏感性，试验用抗生素的种类、药敏纸片含药量及抑菌圈直径判断标准见表1。

1.2.5 数据分析与统计

数据用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析，差异显著者进行Ducan’s多重比较，结果用平均值±标准误表示，显著水平设置为P=0.05。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离、革兰氏染色和过氧化氢酶试验结果

采用含碳酸钙的MRS选择性培养基从自然发酵富源酸菜中分离选出4株具有较强产酸能力的乳酸菌，编号分别为MH-3、MH-4、ZY-3和YS-2。将分离得到的4株菌株进行革兰氏染色、过氧化氢酶试验，检测结果见表2。4株菌株革兰氏染色结果均为阳性，过氧化氢酶试验结果均为阴性，初步判定为乳酸菌。

2.2 16S rDNA序列分析

2.2.1 序列的同源性分析

使用NCBI数据库的BLAST软件，对分离、纯化后4株菌株的16S rDNA序列进行同源性比对，结果如表3所示。

由表3可知，MH-3与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的16S rDNA的相似性达99.63%，MH-4与戊糖乳杆菌（Lactiplantibacillus pentosus）的16S rDNA的相似性达99.55%，ZY-3与德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）的16S rDNA的相似性达99.93%，YS-2与发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）的16S rDNA的相似性达100.00%。