不同脱色方法对油莎豆多糖抗氧化与降血糖活性研究

摘 要：本研究以油莎豆为原料提取多糖，使用活性炭和5种大孔树脂对油莎豆多糖进行脱色，并对脱色后多糖的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制率进行对比评估。结果表明，AB-8弱极性大孔吸附树脂能有效去除多糖色素且多糖保留率较高，此外，脱色后的多糖具有较高的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制率，总酚含量损失也较少。其多糖保留率和蛋白质脱除率分别为71.0%、91.1%，色素去除率为75.2%，总酚含量为8.5 mg/g，多糖浓度为5 mg/mL时，羟基自由基清除率、DPPH自由基清除率和DMPD自由基清除率分别为99.6%、84.1%、73.3%，α-葡萄糖苷酶抑制率为42.2%。

关键词：油莎豆多糖;脱色;抗氧化活性;α-葡萄糖苷酶抑制率

Study on Antioxidant and Hypoglycemic Activity of Polysaccharides from Cyperus esculentus by Different Decolorization Methods

CHEN Yan， ZHANG Runyang， CAI Xiaoshuang， WANG Zubin， LIAO Shuqiang， LIU Huamin*

（School of Food Science and Engineering， Henan University of Technology， Zhengzhou 450001， China）

Abstract： In this study， polysaccharides were extracted from Cyperus esculentus and then decolorized by activated carbon and five macroporous resins. The antioxidant activity and α-glucosidase inhibition rate of polysaccharides after decolorization were evaluated. The results showed that AB-8 macroporous adsorption resin could effectively remove polysaccharides pigment and had a higher polysaccharides retention rate. In addition， the decolorized polysaccharides had high antioxidant activity， α-glucosidase inhibition rate and less loss of total phenol content. The polysaccharides retention rate and protein removal rate were 71.0% and 91.1%， respectively. The pigment removal rate was 75.2%， total phenol content was 8.5 mg/mL. At the concentration of 5 mg/mL， hydroxyl radical scavenging rate， DPPH radical scavenging rate and DMPD radical scavenging rate were 99.6%， 84.1 % and 73.3%， respectively. And α-glucosidase inhibitory rate was 42.2%.

Keywords： polysaccharides from Cyperus esculentus; decoloration; antioxidant activity; α-glucosidase inhibition rate

中国是世界上油料需求最大的国家之一。近年来，中国油料产量虽连年递增，但缺口始终很大，中国每年大豆净进口量约占全球总贸易量的2/3，对外进口的依赖性非常大[1]。“油莎豆”（Cyperus esculentus L.）是油莎草的地下块茎，具有耐盐碱且含油量高（20%～36%）的特点，是集粮、油、牧、饲于一体的经济作物。其油脂中含有75%以上的不饱和脂肪酸，具有较高的营养价值，在油料行业应用前景广阔[2]。据报道，油莎豆具有降血糖、降血脂、保肝以及抗氧化等生理功能[3]。多糖作为油莎豆的主要成分之一，具有重要的生物活性，如免疫调节、降血糖、抗病毒等生物活性功能，具有较大的开发意义[4]。

一般在多糖的提取过程中，多糖中会混有大量色素，这些色素不仅会降低多糖的纯度，也会对多糖的活性和结构鉴定造成严重影响，因此脱色是对多糖深入研究中必不可少的步骤。多糖脱色的方法有很多，包括活性炭脱色、双氧水脱色、大孔树脂脱色等[5]。不同色素脱除的难易程度和最适合的脱除方法是不同的，因此本实验采用了多种脱色方法对油莎豆多糖进行脱色，并对脱色前后的多糖保留率、抗氧化活性、降血糖活性等指标进行测定，对比得出最适宜的脱色方法。而有关不同脱色方法对油莎豆多糖活性的影响在文献中未见报道，因此本实验将为油莎豆多糖的深入研究和应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

油莎豆采购自河北沧州市场，油莎豆经粉碎后过40目孔径筛，索氏抽提后得脱脂油莎豆粉[6];反式-1，2-环己二胺四乙酸、葡萄糖、浓硫酸、硫酸亚铁、水杨酸、双氧水、乙酸钠、氯化铁、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）及抗坏血酸等均为分析纯;N，N-二甲基对苯二胺二盐酸盐（1，4-Amino-N，N-dimethylaniline，dihydrochloride，DMPD）采购于麦克林生化科技有限公司;透析袋（1 000 Da），植物总酚（Total Phenols，TP）含量检测试剂盒，活性炭粉（CAS：7440-44-0），对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG），D900大孔弱碱性阴离子交换树脂，AB-8弱极性大孔吸附树脂，XAD-2非极性大孔吸附树脂，HPD5000极性大孔吸附树脂，D101非极性大孔吸附树脂，糖化酶，采购于索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HL-2B数显恒流泵，上海沪西分析仪器有限公司;BSZ-100数显自动收集器，上海沪西分析仪器有限公司;LGJ18C冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂;UV-6000PC紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司;1410101酶标仪，赛默飞世尔科技公司等。

1.3 试验方法

1.3.1 油莎豆多糖的提取

提取过程根据参考文献[7]，将0.05 mol/L碳酸钠溶液与脱脂油莎豆粉按照1∶15（mL∶g）的液料比混合，搅拌24 h后在4 500 r/min的条件下离心20 min，收集上清液后使用6 mol/L盐酸调其pH值至4.5，搅拌30 min，在4 500 r/min的条件下离心

20 min，舍弃下层的蛋白质沉淀，只收集上清液，将上清液抽滤，滤液调pH值至中性，真空旋蒸浓缩至原体积的1/10，加3倍95%乙醇，4 ℃醇沉3 h[8]。沉淀溶于适量水后用1 000 Da的透析袋进行流水透析，冻干得到油莎豆粗多糖。

1.3.2 油莎豆多糖的脱色

（1）活性炭脱色。配制1 mg/mL的多糖溶液，加入1%的活性炭，在40 ℃条件下慢速搅拌3 h[9]，冰水浴后在4 800 r/min条件下离心30 min，取上清液在45 ℃条件下真空旋蒸浓缩，冻干即得活性炭脱色后的多糖。

（2）大孔树脂脱色。先对树脂进行预处理[10]，然后装柱。配制30 mg/mL的多糖溶液，分别用5种大孔树脂进行脱色，蠕动泵转速为30 r/min，收集多糖溶液。在45 ℃条件下真空旋蒸浓缩，冻干后即得树脂脱色后的多糖。

1.3.3 多糖保留率和蛋白质脱除率的测定

以葡萄糖的浓度（mg/mL）为横坐标，以吸光度为纵坐标，制作标准曲线[11]，采用苯酚硫酸法测定多糖含量，多糖保留率按式（1）计算。

（1）

式中：m1为脱色后得到的多糖质量，mg;m2为脱色前的粗多糖质量，mg。

蛋白质含量的测定采用《出口乳、蛋、豆类食品中蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝法》（SN/T 3926—2014）考马斯亮蓝法，蛋白质脱除率按式（2）计算。

（2）

1.3.4 色素去除率的测定

脱色前后的多糖配制成10 mg/mL的多糖溶液，利用紫外分光光度计，在470 nm处测定吸光度，色素去除率按式（3）计算[12]。

（3）

1.3.5 总酚含量的测定

使用植物总酚（Total Phenols，TP）含量检测试剂盒进行测定，先绘制标准曲线，测定油莎豆多糖中总酚含量时取500 μL多糖溶液，加入2.5 mL检测试剂盒中的提取液，超声提取30 min后在4 800 r/min的条件下离心10 min，取上清液，配制混合溶液，在760 nm处测定吸光度，根据标准曲线进行计算。

1.3.6 抗氧化活性的测定

（1）羟基自由基清除率的测定。分别取10 μL 0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、4.0 mg/mL和5.0 mg/mL的多糖样品溶液，加入50 μL 1.8 mmol/L硫酸亚铁溶液、50 μL 1.8 mmol/L水杨酸乙醇溶液，再加入50 μL 0.3 %双氧水启动反应，铝箔纸封盖，在37 ℃烘箱反应35 min，于510 nm处测定吸光度[12]。以蒸馏水代替多糖样品溶液为空白，以蒸馏水代替双氧水为对照。以维生素C作为阳性对照，按式（4）进行计算。

（4）

（2）DPPH自由基清除率的测定。以无水乙醇为溶剂，配制0.1 mmol/L的DPPH溶液，取25 μL多糖溶液和50 μL 0.1 mmol/L DPPH溶液，避光反应

30 min，于520 nm处测定吸光度。以无水乙醇代替多糖样品溶液为空白，以无水乙醇代替DPPH溶液为对照[13]。以维生素C作为阳性对照，按式（5）进行计算。

（5）

（3）DMPD自由基清除率的测定。将1 mL 0.05 mol/L DMPD溶液与100 mL 0.2 mol/L醋酸盐缓冲液混合均匀，加入0.2 mL 0.05 mol/L FeCl3溶液启动反应，制备成DMPD+溶液。取25 μL多糖溶液和200 μL DMPD+溶液，在室温下反应10 min，于510 nm处测定吸光度。以缓冲液代替多糖样品溶液为空白，以缓冲液代替DMPD+溶液为对照[14]。以维生素C作为阳性对照，按式（6）进行计算。

DMPD自由基清除率=[1-（A样品-A对照）/A空白]×100%

（6）

1.3.7 α-葡萄糖苷酶抑制率的测定

取5 μL多糖溶液、25 μL 500 U/mL α-葡萄糖苷酶、140 μL 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH=6.8）混合，在37 ℃烘箱内反应5 min，再加入25 μL 24 mmol/L PNPG溶液，在37 ℃烘箱内反应15 min，最后加入100 μL 0.2 mol/L Na2CO3终止液，于405 nm处测定吸光度。以蒸馏水代替样品溶液为空白，以蒸馏水代替α-葡萄糖苷酶为对照[15]。按式（7）进行计算。

（7）

2 结果与分析

2.1 不同脱色方法对多糖保留率和蛋白质脱除率的影响

在多糖的提取过程中，常会有大量色素溶出并混入多糖，为了避免这些色素对多糖成品色泽、稳定性、功能性的影响，一般要进行脱色处理，且脱色的重要原则是多糖保留率高、色素去除率高。如图1所示，AB-8脱色后的多糖保留率最高（71.0%），D900脱色后的多糖保留率最低（11.3%）。这是因为采用的大孔树脂极性不同，D900是大孔弱碱性阴离子交换树脂，其脱色后多糖保留率较低，这与D900的表面电特性和氢键相互作用有关[16]。AB-8是弱极性大孔吸附树脂，它比非极性大孔吸附树脂XAD-2和D101表现出更高的多糖保留率，可能是因为AB-8在脱色过程中多糖溶液中的色素和蛋白质易受到强偶极离子力的作用而被吸附，导致AB-8对多糖的吸附较少[17]。XAD-2是一种非极性的大网格树脂，以二乙烯苯为骨架结构，对于一些性质相近的分子和多种环状芳香族化合物有很强的吸附能力。与XAD-2类似，D101大孔吸附树脂是苯乙烯型非极性共聚体，对于不带极性的有机化合物有良好的吸附效果。但是二者孔径相差很大，XAD-2的孔径一般在0.9 μm左右，而D101的孔径只有9～10 nm。因此，XAD-2的吸附量更大，导致多糖保留率低于D101。