酒轻饮对模型生物解酒护肝和胃肠保护作用的研究

摘 要：目的：探讨酒轻饮对模型生物解酒护肝和胃肠保护作用。方法：采用小鼠肝损伤模型、斑马鱼胃肠黏膜损伤、解酒及肝损伤模型，检测肝指数、胃肠黏膜面积、兴奋期总运动距离及生化指标谷丙转氨酶（Alaninetransaminase，ALT）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）含量。结果：兴奋期斑马鱼总运

动距离明显降低（P<0.001）;体内ALT活力检测结果7.81 μL/mL及15.6 μL/mL剂量组明显下降（P<0.01）;昏睡期中高剂量组小鼠翻正反射恢复时间存在显著性缩短（P<0.05）;中剂量组小鼠肝指数明显下降

（P<0.05）;斑马鱼肠腔面积变化明显（P<0.001）。结论：由斑马鱼实验可知，酒轻饮可以起到保护胃肠黏膜、解酒护肝的功效。

关键词：酒轻饮;小鼠;斑马鱼;肝损伤;解酒

Study on the Protective Effects of Jiu Qing Yin on the Liver and Gastrointestinal Tract of Model Organisms

YUE Lintao1， LI Ying1， ZHANG Yongjie2， WEI Fang2， LI Yan1， LI Anping2

（1.Shanxi Zhendong Woohe Medical Care Hall Co.， Ltd.， Changzhi 046000， China; 2.Shanxi Zhendong Pharmaceutical Co.， Ltd.， Changzhi 046000， China）

Abstract： Objective： To explore Jiu Qing Yin on dispel the effects of alcohol， the protective effects of the liver， intestines and stomach of model organisms. Method： Using mouse liver injury model， zebrafish gastrointestinal mucosal injury model， detoxification and liver injury model， the liver index， gastrointestinal mucosal area， total exercise distance during the excitation period and biochemical indicators ALT， AST were measured. Result： During the excitement period， the total movement distance of zebra fish decreased significantly （P<0.001）; decreased in

7.81 μL/mL and 15.6 μL/mL dose groups， ALT activity in vivo was significantly（P<0.01）; during the sleeping period， the recovery time of righting reflex was significantly shortened in the middle and high dose group （P<0.05）; the liver index decreased significantly in the middle dose group （P<0.05）; the intestinal cavity area of zebra fish changed significantly （P<0.001）. Conclusion： According to zebra fish experiment， Jiu Qing Yin can protect gastrointestinal mucous coat， dispel the effects of alcohol and protect liver.

Keywords： Jiu Qing Yin; mice; zebra fish; liver injury; dispel the effects of alcohol

酒，是由一些发酵微生物发酵糖类制成的一种饮料。其主要成分是乙醇[1]。白酒中含有多种风味化合物，包括酯类、醇类、酮类、醛类、酸类、萜烯类及含硫化合物等[2]。饮酒的关键是量的把握。酒带来的危害主要归因于酒精代谢中乙醛的产生，酒精在体内的代谢过程中，大部分酒精是在肝脏中被酶分解代谢[3]。科学研究表明，短期大量摄入酒精易导致急性酒精中毒，长期酗酒则会导致慢性酒精中毒，引起酒精性肝损伤，轻则酒精性脂肪肝，重则肝硬化、肝细胞癌、甚至死亡[4]。

我国饮酒历史长久，对应的也有很多解酒护肝的中药材。桑椹味甘、酸，性寒，归肝、肾经;且《本草纲目》中记载桑椹具有“捣汁饮，解酒中毒;酿酒服，利水气，消肿”的功效[5]。枸杞子味甘、性平，归肝、肾经[6]。现代药理学研究表明，枸杞子具有抗氧化、抗衰老、保肝明目等药理活性[7]。葛根性凉，味甘辛，归脾、胃、肺经，有解表退热、升阳止泻及解酒之功效，具有神经保护和解酒护肝等作用;枳椇子有止渴除烦、利尿解酒之功效[8-9]。代谢组学阐明枳椇子通过调节脂质代谢、三羧酸循环等代谢通路预防肾上腺脑白质营养不良（Adrenoleukodystrophy，ALD）[9-10]。上述原料配伍组合菊花、甘草及蜂蜜，各原料协同增效，既能缓解醉酒症状，又能保护胃肠道和肝脏等。以上述药食同源中草药为主要原料，经过提取浓缩口味调整配制成一种植物饮料，对其功效进行验证。

1 实验动物

动物模型常用啮齿动物，如昆明小鼠、SD大鼠等[11]。而近年来，因与人类基因同源性高（87%）、易于进行转基因操作等特点，斑马鱼成为了一种公认的新型模式生物[12]。斑马鱼体小、生殖周期短、繁殖力强、易饲养、发育快和成本低，是大鼠的1/1 000;对DMSO耐受，易通过皮肤和腔道吸收药物，最大限度地保留了在体活体的系统性[13]。与传统小鼠实验评价相比较，使用斑马鱼模型进行功效评价，实验周期缩短，克服了在体动物实验强度大、周期较长、存在个体差异的缺陷，兼顾了在体动物模型近似人的整体生物反应，已被国内学者广泛接受[13]。

1.1 实验小鼠

选用KM小鼠150只，SPF级，雄性，体重17～20 g，购自西安交通大学医学部动物实验中心，许可证编号：SCXK（陕）2018-001，批号：20210419，质量合格证编号NO.1431。

1.2 斑马鱼

转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼，年龄为受精后3 d（3dpf），用于胃肠道黏膜保护作用评价的最大检测浓度，即最小中毒浓度（Minimum Toxic Concentration，MTC）测定及其作用评价;野生型AB品系斑马鱼，年龄为受精后3 d（3 dpf），用于酒轻饮ALT活力降低作用评价最大检测浓度（MTC）测定及其作用评价;年龄为受精后5 d（5 dpf），用于酒轻饮解酒作用最大检测浓度（MTC）测定及其作用评价。

斑马鱼以自然成对交配繁殖方式进行，每实验组为30尾，均饲养于28 ℃的养鱼用水中，由杭州环特生物科技股份有限公司养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为SYXK（浙）2012-0171，饲养管理符合国际AAALAC认证（001458）的要求[14]。

2 试剂与设备

试剂：AST、ALT测试盒（批号：20210121、20210122，南京建成）;泼尼松（批号C10016501，上海麦克林）;“RU21”（批号：25747，美国精神科学）;美他多辛（批号200401，浙江震元制药）;三硝基苯磺酸（Trinitro-Benzene-Sulfonic Acid，TNBS，批号：SLBT1675，Sigma）;无水乙醇（批号为20200825，国药集团化学试剂）。

设备：旋涡混合仪（常州市万科丰仪器，XH-T）;台式低速离心机（长沙维尔康湘鹰离心机，TDZ5-WS）;精密电子天平（CP214，OHAUS）;CCD相机（VertA1，上海土森视觉科技）;行为分析仪（ZebraLab3.11，ViewPoint）;电动聚焦连续变倍荧光显微镜（AZ100，Nikon）;多功能酶标仪（SPARK，TECAN，Switzerland）;体视显微镜（SZX7，OLYMPUS）。

3 功效实验

3.1 小鼠实验

小鼠分为5组，分别为正常组，模型组，低、中、高剂量组（2.5 mg/kg、5.0 mg/kg、7.5 mg/kg），按相应剂量灌胃30 d，末次给药后测定各项指标。酗酒模型在预防性给药7 d后，每天给酒给药，酒灌胃量14 mL/kg bw。测定小鼠的质量，观察动物的皮肤毛发、情绪反应、行为状态、活跃情况等。测前禁食16 h，按要求测定各项指标。

3.1.1 肝脏质量指数

称量小鼠空腹体重及肝脏质量，计算肝脏质量指数。

3.1.2 生化指标测定

末次给药结束后，各组小鼠眼球取血，制备血清，依照AST、ALT测试盒说明方法进行测定。

3.1.3 解酒醒酒实验

解酒：给药30 min后，每只小鼠灌胃给予56度红星二锅头14 mL/kg。醒酒：给酒30 min后，每只小鼠灌胃受试物。各自观察并记录从第1次给酒至翻转反射消失及恢复的时间。正常组按实验先后顺序灌胃二锅头及等量生理盐水。翻转时间：灌酒完成至翻正反射消失的时间;恢复时间：翻正反射消失至翻正反射再次出现的时间。

3.2 斑马鱼实验

3.2.1 胃肠黏膜保护作用评价

随机选取360尾3 dpf转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼于六孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼。除正常组外，其余各实验组均水溶给予TNBS建立斑马鱼胃肠黏膜损伤模型。28 ℃处理2 d后，移除TNBS，分别水溶给予酒轻饮3.91 μL/mL、7.81 μL/mL、15.6 μL/mL、31.3 μL/mL、62.5 μL/mL、125 μL/mL、250 μL/mL、500 μL/mL和1 000 μL/mL浓度，阳性组泼尼松15.0 μg/mL浓度，同时设置模型组和正常组（养鱼用水处理），每孔容量为3 mL。处理结束后，观察统计各实验组斑马鱼的死亡数量和毒性反应情况，确定酒轻饮的MTC;取MTC及以下共3个浓度组：阳性组、模型组和正常组，每组随机选取10尾斑马鱼在荧光显微镜下拍照并保存图片，用NIS-Elements D3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼肠腔面积（A），以肠腔面积的统计学分析结果评价酒轻饮胃肠道黏膜保护作用。在拍摄分辨率及相关参数相同情况下，像素点越多，面积越大，故用像素作为单位，不再计算实际面积。

3.2.2 解酒作用评价

随机选取360尾5 dpf野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每孔（实验组）均处理30尾斑马鱼，水溶给予无水乙醇建立斑马鱼兴奋期醉酒模型。分别水溶给予酒轻饮3.91 μL/mL、7.81 μL/mL、15.6 μL/mL、31.3 μL/mL、62.5 μL/mL、125 μL/mL、250 μL/mL、500 μL/mL和1 000 μL/mL浓度，阳性组“RU21”100 μg/mL浓度，同时设置模型组和正常组（养鱼用水处理斑马鱼），每孔容量为3 mL。处理结束后，观察统计各实验组斑马鱼的死亡数量和毒性反应情况，确定酒轻饮的MTC;取MTC及以下共3个浓度组、阳性组、正常组和模型组，每组随机选取12尾斑马鱼，用行为分析仪软件分析并采集数据，分析斑马鱼总运动距离（S），以总运动距离的统计学分析结果评价酒轻饮解酒作用。