不同莲子蛋白氨基酸结构与热特性研究

作者: 孙乾 郭增铮 郑玮雯 吴钰涵 郭泽镔

不同莲子蛋白氨基酸结构与热特性研究0

摘 要:目的:研究不同莲子蛋白(分离蛋白、清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白)的氨基酸组成结构与热特性的差异。结果:谷氨酸含量均占比最高,且含有较多带负电荷的极性氨基酸基团。莲子蛋白的E/T、E/N比值与FAO/WHO提出氨基酸比值接近,说明莲子蛋白氨基酸组成与含量均衡。电子能谱中硫元素谱图显示,清蛋白具有更高的吸收峰值,表明其他蛋白中可能含有较多的二硫键,而巯基含量较少。热特性分析表明,莲子蛋白在90 ℃时逐渐变性,200 ℃后发生玻璃化转变,内部有序结构向无序转变。其中分离蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白的热变性温度高,可能是因为分子内部二硫键含量较高,结构紧密,且在热特性变化中重量损失更大,功能性基团改变。结论:分析不同莲子蛋白氨基酸组成、含量以及热特性的差异性,可为莲子蛋白更深入的基础性研究提供科学依据。

关键词:莲子蛋白;分离蛋白;分级蛋白;氨基酸特性;热特性

莲子为睡莲科植物莲的成熟种子,是中国特有的种质资源和经济作物。莲子营养丰富,含有丰富的蛋白质[1-3],因种质资源的不同,蛋白含量最高可达25%[4],且富含多种氨基酸成分[5]。国内外研究学者对莲子蛋白分离以及结构进行了研究,如Zeng等[6]采用Osborne法对莲子蛋白进行分离,并采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)和紫外可见光谱(UV)对分离蛋白进行了结构解析。另有研究者分析了湘莲等莲子蛋白的组成结构以及氨基酸特性,并对莲子蛋白进行了物理与酶法的改性处理[7-8]。Zhang等[9]综述了莲子的营养成分、生理功能及加工,并详细介绍了有关莲子蛋白的不同研究成果。

目前,有关莲子中不同蛋白的研究报道较少,因而深入研究不同莲子蛋白的氨基酸组成结构以及热特性有助于了解莲子蛋白的分子特性,为研究莲子蛋白多尺度结构与功能特性间的构效关系提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

(1)材料:莲子,福建闽江源绿田实业投资发展有限公司。(2)试剂:NaOH、HCl、无水乙醇,天津致远化学试剂有限公司;磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、考马斯亮蓝G250/R250等(均为分析纯),购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器

SQP型电子分析天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;FE 28 pH计:梅特勒-托多利仪器(上海)有限公司;L8900全自动氨基酸分析仪,日立高新技术公司;K-Alpha X射线光电子能谱仪,美国Thermo Fisher Scientific公司;DSC 214差示扫描量热仪,德国耐驰仪器公司;TG 209F3热重分析仪,德国耐驰仪器公司。

2 方法

2.1 莲子分离与分级蛋白的制备

2.1.1 莲子分离蛋白的制备 莲子→磨粉过筛得莲子粉→加去离子水→0.5 mol/L NaOH调pH至9.0→4 000 r/min离心8 min→收集上清液→0.5 mol/L HCl调pH至4.9→4 000 r/min离心8 min→收集沉淀→复溶水洗至中性→真空冷冻干燥→莲子分离蛋白(LSPI)。

2.1.2 莲子分级蛋白的制备 参考Sun等[10]的方法并修改。莲子→磨粉过筛得莲子粉→加去离子水→4 000 r/min离心10 min→收集上清液(莲子清蛋白,LSA)、沉淀→加NaCl→4 000 r/min离心10 min→收集上清液(莲子球蛋白,LSGlo)、沉淀→加70%乙醇→4 000 r/min离心8 min→收集上清液(莲子醇溶蛋白,LSP)、沉淀→0.5 mol/L NaOH调pH至9.0→4 000 r/min离心10 min→收集上清液→0.5 mol/L HCl调pH至4.9→离心→4 000 r/min离心8 min→复溶水洗至中性→真空冷冻干燥→莲子谷蛋白(Lotus Seed Glutein,LSGlu)。

2.2 氨基酸测定

精确称取50 mg莲子蛋白样品于水解管中,加入10 mL HCl,1 g苯酚进行酸水解,充氮封管后,密封条件下在110 ℃烘箱中水解24 h。水解完成后取出冷却,加去离子水定容到50 mL,混合均匀后吸取1 mL到小烧杯中,在烘箱中60 ℃脱酸蒸干处理,加适量超纯水溶解,重复蒸干1~2次后加入样品稀释液复溶,震荡混匀,0.22 μm滤膜过滤,采用L8900全自动氨基酸分析仪进行蛋白质氨基酸组成的分析[11]。

2.3 X射线光电子能谱测定

采用X射线光电子能谱测试莲子蛋白样品,干燥处理,以A1 Ka X(1 486.6 eV)射线源为激发源,发射电压12 kV,电流3 mA,束斑直径0.5 mm,全扫描通道能量100 eV,窄扫描通道能量20 eV。

2.4 DSC测定

根据Jing等[12]的方法加以修改,精确称量1 mg莲子蛋白样品置于DSC铝盘中,空铝盒作为对照。N2保护,N2流速40 mL/min[13-14]。样品升温扫描范围为30~260 ℃,升温速率10 ℃/min。

2.5 TG热重测定

准确称取10 mg莲子蛋白样品,升温区间:30~600 ℃[15-16],升温速率:10 ℃/min,N2保护并控制流速:50 mL/min,记录水分含量、热分解速率峰值温度、质量变化过程[17]。

2.6 数据处理

各组试验数据均重复3次,P<0.05被认为数据之间具有显著差异;研究结果采用Origin 8.5作图,光谱图采用自带软件进行分析。

3 结果与分析

3.1 氨基酸分析

氨基酸的组成与比例决定了蛋白的营养质量。表1显示,必需氨基酸含量占氨基酸总量的(E/T)37.22%~42.87%,亮氨酸含量占比最高(15.11%~25.39%),且大多为疏水氨基酸;非必需氨基酸与必需氨基酸之比(E/N)为59.29%~75.04%,含量占氨基酸总量的(N/T)57.13%~62.79%,谷氨酸含量占比最高18.42%~25.91%;支链氨基酸含量占氨基酸总量的(B/T)18.83%~19.91%。

莲子蛋白的E/T、E/N比值与FAO/WHO提出的必需氨基酸占总氨基酸的比值为40%、必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为60%以上的参考蛋白模式相符且部分含量高于参考比值[18],说明莲子蛋白氨基酸组成与含量均衡,具有在食品加工中综合利用的潜能。由表2与图1可知,非极性氨基酸含量占比35.24%~38.61%;不带电荷的极性氨基酸含量占比19.35%~25.13%;疏水性氨基酸及芳香族氨基酸含量占比33.45%~36.16%。通过以上数据表明,在莲子各蛋白中,谷氨酸的含量均占比最高,表明含有较多带负电荷的非极性氨基酸基团。此外,谷蛋白、醇溶蛋白中所占疏水性氨基酸较多,而清蛋白、球蛋白、分离蛋白中所占亲水性氨基酸较多,这种组成差异与莲子蛋白的溶解度等理化功能特性密不可分。

3.2 X射线光电子能谱

X射线光电子能谱分析(XPS)用于固体表面成分分析,包括表面的化学元素组成、原子价态及表面能态分布等。如图2所示,广谱显示出非常高强度的C1S、O1S元素信号,而N1S、S2P信号相对较弱。但较为明显的是,莲子分离蛋白与分级蛋白中均含有C、N、O、S这4种元素,没有新共价键的产生,即C、N、O、S元素的价态、峰值变化只有略微漂移。在各种信号中,清蛋白在含量上与其他蛋白有较大差异,这可能与清蛋白的所含极性氨基酸的组成结构不同有关。C1S光电子能谱中主峰位置出现在284.5 eV附近(即C-C键合),这个主峰由典型的碳原子所发出的光电子产生[23-24]。清蛋白与谷蛋白的O/C值与其他蛋白相比,有不同程度的增加,这是由于其中含有氧自由基、-OH基团等含氧高能粒子基团,在分子链中有-OH、C-O、-COOH、C=O等含氧官能团,使氧元素增加,提高了O/C值[24]。在399 eV附近的为N峰,除谷蛋白的峰值较强外,其余蛋白均不十分明显。结合能在163 eV附近位置是-SH的出峰位置,在S元素的分峰图谱中,球蛋白的峰值强度最大,而其他蛋白的峰值相对较弱,表明其他蛋白中-S-S-相对更多,降低了-SH含量[25]。

3.3 DSC分析

差示扫描量热分析(DSC)是反映物质发生物理或化学变化时吸收或释放热量的多少,是分析蛋白质三级结构的一种有效方法[26]。T0为起始变性温度、Td为最大变性温度,Td越高则热稳定性越高。热转变半峰宽值(T1/2)可判断蛋白质变性协同,若蛋白质变性在较窄的温度范围内发生,说明蛋白质变性具有较好的协同性[26]。变性焓值(ΔH)使蛋白质变性所需要的热量,与蛋白质的结构有序程度有关,破坏氢键产生吸热焓,蛋白质聚集或疏水反应产生放热焓。由图3可以看出,在90 ℃附近的峰值变化说明了蛋白质开始逐渐向变性转变,内部的有序结构也开始向无序结构转变。

分离蛋白的T0为70.10 ℃,均比分级蛋白(清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白)高,其次为醇溶蛋白(60.90 ℃)与谷蛋白(55.57 ℃)。分离蛋白初始变性温度较高,可能是因为分离蛋白中含有多种蛋白以及杂蛋白,导致不同蛋白分子间,以及蛋白分子内部相互作用。而醇溶蛋白、谷蛋白的疏水性氨基酸相对较多,且在蛋白质内部不易暴露出来,因而使蛋白质具有保持三级结构的能力。 Td值的变化趋势与T0相同,最高为分离蛋白的101.42 ℃,表明蛋白质内部结构紧密。张羽[27]认为,由于分离蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白中-S-S-含量较高,打破-S-S-解旋蛋白质折叠结构所需的能量更多,因而热变性温度相对越高。协同性最好的是球蛋白,T1/2只有22.12 ℃,这可能是因为球蛋白亲水与疏水的双面性更好,与极性分子接触时,可展现出更好的分子柔性和协同性。表3中数据说明,分离蛋白ΔH为1.41 J/g,分级蛋白ΔH大小依次为谷蛋白>醇溶蛋白>清蛋白>球蛋白,球蛋白的ΔH值仅是分离蛋白的0.11倍。有相关研究表明,ΔH值的增加反映了蛋白质在升温过程中的综合吸热效应,例如氢键的断裂等,其值的高低与蛋白质内部空间结构的有序排列有关[28]。因而可以说明,谷蛋白的空间结构有序性高于分离蛋白,比清蛋白、球蛋白的空间结构更加有序和稳定[29]。但这与蔡联辉等[30]之前的研究并非相同,其认为清蛋白、球蛋白的稳定性要高于醇溶蛋白、谷蛋白,这可能是因为莲子的不同分类,其分子结构与功能特性的不同。蛋白在生产应用过程中,受热是最为常见的加工方式之一,而蛋白质在受热后分子结构会发生伸展、聚集等状态,由此其功能特性也会受到相应的影响[31]。受热过程可以破坏氢键、疏水、静电以及二硫键等相互作用,从而导致蛋白质结构与功能性质发生变化[32]。

3.4 TG热结构性分析

热重分析仪TGA能够测量物质的质量随温度(或时间)的变化关系。10 ℃/min升温速度后样品发生吸热和放热改变,氨基酸残基被降解,进一步降低了其热分解稳定性。莲子蛋白从30~600 ℃的热分解速率曲线主要分为两个阶段[33],其热分解TG、DTG曲线见图4[34-35]。

第一阶段30~150 ℃,初始阶段重量有5%~7%的轻微损失,主要为结合水的挥发和损失[16,34],温度升高引起小分子蛋白(氨基酸残基肽键之间共价键的断裂)的分解并导致莲子蛋白重量损失[18,33],降低了蛋白质与水的结合能力[35];第二阶段150~540 ℃,莲子蛋白骨架结构(S-S、O-N、O-O键断裂[18,34])被分解,释放出各种气体,如CO2、CO、NH3等[36],表明分子内-S-S-断裂,与分离蛋白与清蛋白相比(损失在63%左右),醇溶蛋白与谷蛋白在此阶段重量损失更大(损失在73%左右),这可能是因为化学反应过程中功能性基团改变,蛋白质分子逐步完全被分解,醇溶蛋白与谷蛋白在此阶段的峰值也比分离蛋白与清蛋白高,说明分离蛋白与清蛋白的分子柔性相比醇溶蛋白与谷蛋白更高,而醇溶蛋白与谷蛋白分子“刚性”更强。由于蛋白类制品在应用时常需要高温处理,利用热重分析研究莲子蛋白的热稳定性,可为莲子蛋白在实际生产加工提供科学依据[35]。

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