双歧杆菌液态厌氧发酵牡蛎制品的体外抗氧化能力分析与比较

摘 要：目的：分析对比不同双歧杆菌液态厌氧发酵牡蛎制品的体外抗氧化能力，为牡蛎高值化利用提供科学依据。方法：通过双歧杆菌液态厌氧发酵牡蛎获得相应制品；通过测定总抗氧化能力以及DPPH自由基清除、抑制羟自由基、抑制超氧阴离子自由基能力，分析并比较各发酵制品的抗氧化活性；通过BCA比色法测定各发酵制品中总肽的含量。结果：获得青春、两歧、婴儿双歧杆菌液态厌氧发酵牡蛎制品；与空白对照相比，3株双歧杆菌的发酵牡蛎制品的总抗氧化能力均有显著提升，且3组之间也差异显著：两歧双歧杆菌组＞婴儿双歧杆菌组＞青春双歧杆菌组；3组均有一定的自由基抑制清除能力；3组总肽含量相近，各组之间无显著性差异。结论：双歧杆菌液态厌氧发酵可提高牡蛎制品的体外抗氧化能力，且具有菌株特异性，为丰富益生菌及海洋食药资源的应用提供科学依据。

关键词：双歧杆菌；牡蛎；体外抗氧化能力；发酵

牡蛎是我国重要的传统药食两用资源，也是目前最主要的经济贝类，产量高居世界之首[1]。牡蛎一直以来以传统加工产品为主，附加值较低[2]。近年来，牡蛎制品逐渐融入现代食品加工高新技术，进行精深加工和高附加值化利用，其功能肽成为产品研发的一大热门方向[3]。陈宏等[4]通过酶解牡蛎肉制备了高抑制活性的DPP-Ⅳ抑制肽。QIAN B等[5]通过酶水解从牡蛎软组织中提取了抗氧化和抗炎肽组分。目前，功能肽的制备方法主要以酶解法为主，但酶解过程容易产生多种副产物，且酶若选择不当，产率及活性均较低[6]。微生物发酵法是通过菌种在生长代谢过程中产生的蛋白酶水解底物，是生物体自带的复合酶系，操作便捷、经济且产物往往具有更高的产率和活性[7]。高洁等[8]采用纳豆芽孢杆菌发酵扇贝制备的ACE抑制肽，其活性相比酶解法制备的更高。

双歧杆菌是人体肠道常驻菌，也是食品工业中常用的发酵菌株，具有营养、拮抗、增进风味、发挥益生功能等诸多作用[9]。冯红霞等[10]利用双歧杆菌发酵制作迷迭香扣碗酪，不仅别具风味，还兼具良好的抗氧化活性。Nealon N J等[11]证实，长双歧杆菌发酵米糠能影响肠道微生物组和代谢组。目前，双歧杆菌多用于发酵乳及果蔬粗粮制品，用于发酵贝类的报道相对较少。因此，本研究以总抗氧化能力、自由基清除抑制能力等为指标，分析并对比3株双歧杆菌液态厌氧发酵牡蛎制品的体外抗氧化能力及总肽含量，旨在为牡蛎高值化利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）、两歧双歧杆菌（B.bifidum）、婴儿双歧杆菌（B.infantis），本实验室保存；牡蛎冻干粉，陕西东禾福；蔗糖，国药集团；MRS肉汤培养基，北京索莱宝；总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒（比色法）、DPPH自由基清除能力试剂盒、羟自由基测试试剂盒、抑制与产生超氧阴离子自由基测定试剂盒（比色法）、总蛋白定量测定试剂盒（BCA比色法），南京建成；其余分析纯化学试剂，西陇科学。

1.2 仪器与设备

Anaerobox IV型厌氧培养箱，美国Gene Science；3K15冷冻台式离心机，德国SIGMA；Quintix5102电子天平，德国Sartorius；Vortex 3漩涡混匀器，德国IKA；GR88DR高压灭菌锅，厦门致微；UV-5100B紫外可见分光光度计，上海元析；HWS-24水浴锅，上海一恒；FE28酸度计，上海梅特勒托利多。

1.3 双歧杆菌液态厌氧发酵牡蛎制品的制备

将青春、两歧、婴儿双歧杆菌的冻存甘油管取出，接种于MRS肉汤，37℃、厌氧培养48 h使其完全活化，再以1%接种量转接，同上条件培养至生长对数期，制成109 CFU/mL的种子菌悬液，备用。称取牡蛎冻干粉4.0 g、蔗糖0.4 g、蒸馏水100 g，混匀，调节pH至6.2～6.6，配成4%牡蛎培养基，灭菌备用。以10%接种量分别接入青春、两歧、婴儿双歧杆菌的种子菌悬液，37 ℃、厌氧培养24 h。以未加菌液的牡蛎培养基为空白对照。发酵完成后，8 000 r/min离心10 min，收集的发酵上清再经0.22 μm微孔滤膜过滤，获得双歧杆菌液态厌氧发酵牡蛎制品。

1.4 总抗氧化能力的测定

按照总抗氧化能力（T-AOC）检测试剂盒（比色法）说明书的要求，设置测定管、对照管，分别配制并加入相应试剂，漩涡混匀，37 ℃水浴30 min，再加后部分试剂，混匀后25 ℃静置10 min，设置520 nm波长，1 cm光径，以双蒸水调零后测定吸光度并按推荐公式计算总抗氧化能力。

1.5 自由基清除抑制能力的测定

1.5.1 DPPH自由基清除能力的测定 按照DPPH自由基清除能力试剂盒说明书的要求，设置空白管、对照管、测定管，分别配制并加入相应试剂，混匀，25℃避光静置30 min，设置517 nm波长，1 cm光径，以无水乙醇调零后测定吸光度并按推荐公式计算DPPH自由基清除能力。

1.5.2 抑制羟自由基能力的测定 按照羟自由基测试试剂盒说明书的要求，设置空白管、标准管、对照管、测定管，分别配制并加入相应试剂，迅速混匀，37 ℃精确计时水浴60 s，再立即加入显色剂，混匀，25 ℃静置20 min，设置550 nm波长，1 cm光径，以双蒸水调零后测定吸光度并按推荐公式计算抑制羟自由基能力。

1.5.3 抑制超氧阴离子自由基能力的测定 按照抑制与产生超氧阴离子自由基测定试剂盒说明书的要求，设置对照管、标准管、测定管，分别配制并加入相应试剂，漩涡混匀，37 ℃水浴40 min，再加入显色剂，混匀，25 ℃静置10 min，设置550 nm波长，1 cm光径，以双蒸水调零后测定吸光度

并按推荐公式计算抑制超氧阴离子自由基能力。

1.6 总肽含量的测定

按照总蛋白定量测定试剂盒（BCA比色法）说明书的要求，设置空白管、标准管、对照管，分别配制并加入相应试剂，漩涡混匀，37 ℃孵育30 min，加入终止剂，再次漩涡混匀，静置5 min，设置562 nm波长，0.5 cm光径，以双蒸水调零后测定吸光度并按推荐公式计算总肽含量。

1.7 数据处理及分析

如无特别标注，实验平行测定3次，采用GraphPad Prism version 5.01进行数据分析及图形绘制，数据表示为均值±标准偏差（X±SD）。

2 结果与分析

2.1 总抗氧化能力的测定

由图1可知，空白对照组的总抗氧化能力为（0.74± 0.11）U/mL，青春双歧杆菌组为（3.21±0.14）U/mL，两歧双歧杆菌组为（4.93±0.28）U/mL，婴儿双歧杆菌组为（3.82±0.15）U/mL。结果表明，与空白对照相比，青春、两歧、婴儿双歧杆菌液态厌氧发酵牡蛎制品的总抗氧化能力均有显著提升（P＜0.05），而且3个实验组之间总抗氧化能力也存在显著性差异（P＜0.05），顺序为两歧双歧杆菌组＞婴儿双歧杆菌组＞青春双歧杆菌组。因此，在该基础上继续评估其DPPH自由基清除、抑制羟自由基、抑制超氧阴离子自由基能力。

2.2 自由基清除抑制能力的测定

由图2A可知，青春双歧杆菌组的DPPH自由基清除能力为（40.75±1.22）μg Trolox/mL，两歧双歧杆菌组为（41.89±1.37）μg Trolox/mL，婴儿双歧杆菌组为（37.41±1.09）μg Trolox/mL，表明3组均有一定的DPPH自由基清除能力，且两歧双歧杆菌组＞青春双歧杆菌组＞婴儿双歧杆菌组，其中两歧双歧杆菌组与青春双歧杆菌组之间无显著性差异（P＞0.05），但两者与婴儿双歧杆菌组相比，均显著更高（P＜0.05）。由图2B可知，青春双歧杆菌组的抑制羟自由基能力为（35.78±0.09）U/mL，两歧双歧杆菌组为（34.98±0.57）U/mL，婴儿双歧杆菌组为（35.31±0.82）U/mL，表明3组均有一定的抑制羟自由基能力，且青春双歧杆菌组＞婴儿双歧杆菌组＞两歧双歧杆菌组，但3组之间均无显著性差异（P＞0.05）。由图2C可知，青春双歧杆菌组的抑制超氧阴离子自由基能力为（33.73±0.08）U/L，两歧双歧杆菌组为（22.93±0.38）U/L，婴儿双歧杆菌组为（28.04±0.65）U/L，表明3组均有一定的抑制超氧阴离子自由基能力，顺序为青春双歧杆菌组＞婴儿双歧杆菌组＞两歧双歧杆菌组，且3组之间均存在显著性差异（P＜0.05）。

2.3 总肽含量的测定

由图3可知，青春双歧杆菌组中总肽含量为（4.05±0.18）mg/mL，两歧双歧杆菌组为（4.17±0.15）mg/mL，婴儿双歧杆菌组为（4.23±0.07）mg/mL，表明3组中总肽含量相近，各组之间无显著性差异（P＞0.05）。

3 讨论

利用低附加值但又富含蛋白的加工副产物制备抗氧化肽逐渐受到关注[12]。潘风光等[13]等利用大豆残存渣粕，制备出较好活性的抗氧化肽。洪燕婷[14]酶解制备了海鲈鱼鳞抗氧化肽。研究表明，相比陆源抗氧化肽，海洋源抗氧化肽具有更广泛的原料来源、独特的氨基酸序列结构、美好的发展前景[15]。此外，利用益生菌双向发酵中药可促进体系内有效组分析出，并转化出新的活性成分，从而增强、增加药效[16]。红曲霉与金钗石斛双向发酵可调节代谢途径、提升制品的抗氧化活性[17-18]。李慧星等[20]发现，蛹虫草菌质-山药基质双向发酵体系具有抗氧化活性增效特点。中国的牡蛎产量高居世界之首，而福建省产量又高居全国之首，资源尤为丰富[1-2]。然而，福建牡蛎产业目前精深加工不足，产品附加值低[3]。因此，为提高牡蛎原料利用率、提升其药食同源价值，本研究选用青春、两歧、婴儿双歧杆菌，通过液态厌氧发酵增强牡蛎制品的抗氧化活性。结果表明，牡蛎经不同的双歧杆菌发酵后，其制品的总抗氧化能力均有显著提升，为通过益生菌发酵以高值化利用牡蛎提供了科学依据。

发酵制品活性强弱与所选用的微生物菌株密切相关，陈应运等[20]发现，纳豆芽孢杆菌GL-12用于发酵蛤蜊比其他菌株具有更好的活性。孙百虎[21]对比了植物乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌4株乳酸菌发酵桑葚汁的抗氧化活性，结果表明，以植物乳杆菌的发酵性能最好、抗氧化活性最高。本研究也发现，两歧、婴儿、青春双歧杆菌发酵牡蛎制品的总抗氧化能力存在显著性差异，以两歧双歧杆菌的最高。两歧双歧杆菌被认为是健康母乳喂养婴儿的肠道主导菌，不仅具有较好的细胞粘附性和免疫调节活性，还具有生物转化增效能力[22]。此外，司倩等[23-24]发现，两歧双歧杆菌可用于缓解2型糖尿病和结肠炎症状。因此，两歧双歧杆菌或是较适于发酵牡蛎制备高抗氧化活性制品的益生菌菌株。

值得关注的是，虽然两歧双歧杆菌发酵牡蛎制品的总抗氧化能力最高，且DPPH自由基清除能力也较强，但抑制羟自由基能力与其他两株并无显著差异，其抑制超氧阴离子自由基的能力反而在3组中最弱，这预示各菌株发酵或存在不同的代谢转化途径，从而具有不同的自由基清除抑制机制。李思宁[25]也发现类似研究结果，相比植物乳杆菌，动物双歧杆菌发酵乳的DPPH自由基清除率更高，但羟自由基清除率却更低。此外，经初步测定，3组中总肽含量相近，而其抗氧化活性却差异显著，表明两歧双歧杆菌发酵牡蛎制品中或存在高活性的抗氧化肽，需要后续纯化、鉴定及验证[26]。

参考文献

[1]国家贝类产业技术体系.中国牡蛎产业发展报告[J].中国水产，2021（6）：20-31.

[2]李美琪，郭昕竺，李辉尚，等.“十三五”以来中国牡蛎产业发展形势分析与对策研究[J].中国食物与营养，2020，26（8）：9-13.