铁皮石斛PCR鉴定引物的比较和筛选研究

摘要：目的：比较并筛选基于PCR技术的铁皮石斛成分鉴定的高特异性和高灵敏度引物。 方法：选取1组专利报道和2组文献报道的铁皮石斛特异性PCR鉴定引物，优化其退火温度，比较其特异性和灵敏度，筛选出高特异性和高灵敏度的引物。 结果：3组引物的扩增能力、特异性和灵敏度均存在差异，其中1组以铁皮石斛ITS2区为靶标、引入错配碱基的双阻滞铁皮石斛成分鉴定引物，具有最佳的特异性和灵敏度。结论：通过比较3组铁皮石斛特异性PCR引物，优选出1组铁皮石斛成分鉴定引物，为铁皮石斛成分及其产制品的鉴定提供了参考依据。

关键词：铁皮石斛；真伪鉴定；引物；特异性；灵敏度铁皮石斛为兰科石斛属多年生草本植物[1]ADDINNE.Ref.{54166D22-E517-4084-8F70-B3213B93AA72}，具有滋养阴津、提高免疫力、抗氧化、促消化等多种药用和食疗功能[2-3]ADDINNE.Ref.{BC806DA9-8879-4364-B2EE-7BB76502168E}。由于铁皮石斛药用和食用价值高，市场需求量大，供需失衡导致其价格节节攀升，市场上以次充好、掺假充真的情况屡禁不止。我国石斛共有76个品种和2个变异品种，常见的品种就有15个左右[4]ADDINNE.Ref.{EF492777-2F85-4174-93D4-FA25F38E2F78}。铁皮石斛与其近缘种外形相似，特别是加工成枫斗等产制品后，更难以从外形上区分[5-6]ADDINNE.Ref.{F56C271D-5B76-46B7-87D3-C07E91B75ECA}。因此，为有效防止掺假伪劣品种流入铁皮石斛市场，提高铁皮石斛及其制品的质量，亟需建立灵敏、快速、有效的铁皮石斛鉴定方法。

分子鉴定作为新兴的动植物源性成分鉴定手段，具有准确度高、重现性好等优点，在铁皮石斛鉴定中的应用研究也日益深入[7]ADDINNE.Ref.{8A6FF192-40AD-4C6F-8F4D-E3DC5EA899FA}，其中DNA条形码技术和分子标记方法应用较为广泛。但DNA条形码技术对仪器配置和人员专业要求高，尚难以在基层推广；分子标记技术则多用于育种研究，重复性和稳定性尚不能满足检验需求。因此，需要开发更为快捷、易于推广的铁皮石斛分子鉴别方法。

尽管已有不少铁皮石斛特异性PCR检测方法的报道，但这些方法建立在不同实验条件、引物及检测标靶上，检测效果难以比较和评价。目前，各地食药检验机构大都具备开展常规PCR检测能力，在此基础上开发有效的针对铁皮石斛PCR鉴别方法，更适于在基层推广应用。本研究选择并比较了3组不同特征的铁皮石斛PCR鉴定引物[8-10]ADDINNE.Ref.{C677EFBE-D179-4249-8260-85C13C798835}，旨在筛选出适用于基层检验的高特异性和高灵敏度的铁皮石斛特异性鉴定引物，也可为后续铁皮石斛多重分子鉴定方法的开发提供基础。

1材料与方法

1.1材料与试剂

铁皮石斛对照药材（批号：121501-201402），购自中国食品药品检定研究院。其余样品：铁皮石斛，采自浙江乐清；霍山石斛，采自安徽霍山；金钗石斛、流苏石斛、鼓槌石斛、重唇石斛、齿瓣石斛和杯鞘石斛，采自云南宁洱；石仙桃，采自广东肇庆，经台州市药品检验研究院鉴定，取其叶用于DNA抽提。试剂：植物基因组DNA提取试剂盒（DHelix）、TaqTM Hot Start Version（Takara）、S2标准卡夹（Bioptic）；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2仪器与设备

T100 PCR扩增仪（Bio-Rad）、Lysera高通量组织研磨仪（Biotage）、Nanodrop One超微量核酸蛋白测定仪（Thermo）、Qsep100全自动核酸蛋白分析仪（Bioptic）、ST8R低温冷冻离心机（Thermo）。

1.3引物来源

本研究比对的3 组铁皮石斛PCR鉴定引物分别来自发明专利[8]ADDINNE.Ref.{3E66C777-C00A-462B-951A-D8220D3A8712}、文献A[9]、文献B[10]ADDINNE.Ref.{DD779266-95C2-4760-82E3-B0C59D0A7294}，检测方法均为普通 PCR，各引物信息详见表1。其中，T1以铁皮石斛ITS2为靶标；T2同样以ITS2为标靶，为引入错配碱基的双阻滞特异性引物；T3则为基于SCoT标记筛选出的铁皮石斛特异性扩增引物。同时应用ITS2通用引物对各样本进行DNA条形码鉴定[11]ADDINNE.Ref.{EA02F413-F17F-4888-AC50-DA5863F8FC15}。

1.4方法

1.4.1DNA提取及核酸质量检测对照药材直接称取50 mg；其余样本取鲜叶，冷冻研磨后称取100 mg。参照植物基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，检测其浓度及质量 （A₂₆₀/A₂₈₀ 在 1.6～2.0 时DNA 质量满足实验要求），4 ℃保存待用。

1.4.2DNA条形码检测为确保DNA样本来源与记录名称一致，使用ITS2通用引物对本研究所使用的样本开展DNA条形码检测。目标PCR产物送至生工公司克隆测序，经BLAST比对（http：//blast. ncbi. nlm. nih. gov），确认样品种属。

1.4.3PCR退火温度优化使用铁皮石斛对照药材开展3对引物的退火温度优化实验，相关设置见表2，退火温度梯度范围为55～65 ℃。PCR仪根据设定的温度范围，自动分配8个退火温度，每个温度设2个平行。PCR反应液配置如下：10×PCR Buffer （Mg²⁺ plus） 2.5 μL、dNTP Mixture （各2.5 mmol/L） 1 μL、TaKaRa Taq HS （5 U/μL） 0.3 μL、DNA 50 ng、上下游引物按表2设置加入，超纯水补足总体积至25 μL。目标PCR扩增产物送至生工公司进行克隆测序，以确认是否为目标序列。

1.4.4PCR扩增特异性比较选择最佳退火温度，使用待评价引物，分别对铁皮、霍山、金钗、流苏、鼓槌、重唇、齿瓣和杯鞘石斛及石仙桃进行PCR扩增，比较其特异性，每个样本设2个平行。

1.4.5PCR扩增灵敏度比较选择最佳退火温度，使用待评价引物，对连续梯度稀释的铁皮石斛对照药材DNA进行PCR扩增，比较其扩增灵敏度。DNA梯度浓度分别为50、10、5、1、0.5、0.1、0.05 ng/μL，每个PCR体系加入1 μL DNA模板，每个浓度设3个平行。

2结果与分析

2.1DNA条形码鉴定结果

使用ITS2通用引物对各样本进行扩增，产物片段大小约为500bp，与预计一致，克隆测序结果经BLAST比对，确认样本来源与预期一致。

2.2PCR退火温度优化结果

由图1可见，8个梯度退火温度检测，T1均未扩增得到预期136bp的目标产物，说明该引物无法对铁皮石斛进行有效扩增。T2和T3均扩增得到预期的397bp和197bp的目标产物，经序列比对分析确认扩增序列为目标序列。综合分析条带亮度及非特异扩增条带，分别选择61.1 ℃和58.8 ℃作为T2和T3的最佳退火温度。

2.3引物特异性分析

使用最佳退火温度对T2和T3的扩增特异性进行分析。由图2可见，T2仅铁皮石斛扩增得到397bp的目标条带，其他样品均无非特异性扩增，说明T2特异性佳；T3也具有良好的特异性，仅铁皮石斛扩增得到197bp的目标条带，但齿瓣石斛在300bp和800bp附近出现非特异扩增，需注意区分。

2.4引物灵敏度分析

使用最佳退火温度对连续梯度稀释的铁皮石斛对照药材DNA进行PCR扩增。如图3所示，随着DNA模板量的下降，PCR扩增产物浓度总体呈下降趋势。当铁皮石斛DNA模板量低至0.05 ng/μL时，T2仍能扩增得到清晰的目标条带；但当铁皮石斛DNA模板量为0.5 ng/μL时，T3已无法扩增得到目标条带，因此T3灵敏度欠佳。综上，引物T2的鉴别灵敏度更高，能更好地满足实际检测需求。

3讨论与结论

2020年版《中国药典》对铁皮石斛的鉴别采用性状鉴别、显微鉴别和化学鉴别等方式[1]ADDINNE.Ref.{4E40F4AD-B590-424B-A59F-A4E8B7EAA1A2}。这些传统的鉴别方法得到的结论往往不够完善，特别是对于加工后丧失铁皮石斛形态的粉末或液体制剂更难进行有效鉴定，且检测结果易受外界因素及生物体发育阶段的影响。此外，中国药典以多糖和甘露糖的含量测定为指标对铁皮石斛进行质量控制，但这些指标并非铁皮石斛特有，因此难以鉴别铁皮石斛同属伪品[1]ADDINNE.Ref.{A0CA587E-7DD9-48CD-850D-4854906EA1F7}。

PCR作为一种高效、便捷、准确的动植物源性成分鉴定手段，已在食品药品源性成分鉴别上有了非常广泛的应用。本研究选择了具有代表性的3组不同特性的铁皮石斛特异性PCR鉴定引物，对其进行了退火温度的优化及特异性和灵敏度的比较。结果表明，来自专利[8]ADDINNE.Ref.{80C180BE-1866-4E7B-A6AD-9F7484E1135E}的以铁皮石斛ITS2为靶标的特异性PCR引物无法扩增得到铁皮石斛特异性目标片段，这可能是由于ITS2区存在较多多态性位点[12]ADDINNE.Ref.{AFC469D8-A74A-4D9A-A8B0-142EF8861106}，该专利在引物设计时参照的ITS2序列与本研究所选用的铁皮石斛ITS2序列在引物区域存在差异，因此在对铁皮石斛进行特异性引物设计的时候，可结合收集到的样品序列及NCBI等基因数据库中报道的序列，综合比对序列之间的特异性和多态性位点才能更加准确地开展相关引物的设计。文献A[9]ADDINNE.Ref.{2348BDC3-0811-4627-B234-1A4005C309D6}同样基于铁皮石斛ITS2区，选择2个SNP位点设计了1对在3′端倒数第2位引入错配碱基的双阻滞特异性引物，可特异性扩增铁皮石斛，后续检测表明该方法具有良好的特异性和灵敏度，检测限低于0.05 ng/μL，这可能与该引物所使用的SNP位点位于具有高拷贝数的ITS序列有关。文献B[10]ADDINNE.Ref.{891E0521-5C30-4EFB-9B12-E980F8E50B8E}则基于新型的SCoT标记筛选出铁皮石斛特异性扩增引物，检测结果表明该引物可特异性扩增铁皮石斛，但检测灵敏度欠佳，且存在较多非特异性扩增产物，这可能是由于该引物通过分子标记筛选，基因组中存在多处可与引物结合的序列，产生了非特异性扩增，进而影响结果判定。

因此，综合考虑3对引物对铁皮石斛的扩增能力、特异性及灵敏度，来自文献A的T2引物可作为铁皮石斛成分鉴定的首选，并可进一步推广应用于实际检测工作中，该方法也可为后续铁皮石斛的多重分子鉴定及定量检测方法的开发提供基础。参考文献

[1]中华人民共和国药典（一部）[M]. 北京：中国医药科技出版社， 2020.

[2]侯北伟， 胡永青， 姚正颖， 等. 铁皮石斛产品质量影响因素分析及发展对策[J].中国野生植物资源， 2019，38（5）：84-87.

[3]XU X Y， ZHANG C， WANG N， et al. Bioactivities and Mechanism of Actions of Dendrobium officinale： A Comprehensive Review[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2022，（2022）：1-21.

[4]王枫，石红青.我国铁皮石斛产业发展研究[J]. 中国林业经济， 2019（3）：88-90.