黑枣醋蛋液响应面法工艺优化及醋蛋水解度影响因素分析

摘要：目的：开发一款营养功能兼具的黑枣醋蛋液产品。方法：通过响应面试验优化了黑枣醋蛋液工艺参数，研究了黑枣醋蛋液蛋白质水解度的影响因素。结果：最优工艺参数为醋蛋比质量比为3：1、浸泡温度为30 ℃、浸泡时间为60 h；对比不同pH处理可知，在保证醋蛋液品质的基础上，pH 3.0最适合醋蛋水解，此时蛋白质水解度最高，可达22.6%；25 ℃时醋蛋水解度最高为20.0%；金属离子的加入能够促进醋蛋水解，亚铁离子、钙离子、锌离子、铜离子均在浓度为60 mmol/L时，黑枣醋蛋液水解度达到最高，分别为26.6%、28.2%、23.6%、23.0%。结论：最优工艺下生产的黑枣醋蛋液质量稳定，醋蛋水解度可达20.23%，且不同pH、温度以及金属离子均对醋蛋水解度有一定影响。

关键词：黑枣醋蛋液；响应面优化；醋蛋水解度醋蛋液是由禽蛋浸泡于米醋中而成，同时具有醋与鸡蛋的各种营养成分。醋蛋液营养保健价值极高，在国内外均属传统食疗保健品，具有提高免疫力、降血压、降血脂、抗氧化、补钙、防治心血管疾病、治疗扁平疣等作用[1-6]。黑枣是由红枣经控温控湿发酵而成[7]。红枣黑化过程中通过非酶褐变反应使其口感、原有成分及功能发生变化[8]。同时黑枣还兼具红枣抑制癌细胞、保肝护脾、美容护肤、补气养血、增强人体免疫力、预防心血管疾病等主要作用[9]。

杨萍芳[10]优化得到醋蛋液浸泡的最优条件为醋蛋比值3.2、浸泡时间64 h、浸泡温度24 ℃，蛋白质水解度可达37.19%。艾华[11]研究表明，醋蛋液有良好的调节血脂和抗氧化作用。李琳[12]研究表明，醋蛋液具有降压作用。前人研究主要集中在传统醋蛋液工艺优化及功能方面，对于新型醋蛋液的开发以及浸泡过程中外界因素对醋蛋液蛋白成分的影响研究较少。本试验以黑枣醋浸泡禽蛋，一方面减少蛋腥味，增加枣香味，同时也会增加其营养成分，提高功能特性，明确外界因素对醋蛋液中蛋白水解度的影响对醋蛋液的制备、储存与推广具有重要影响。

1材料与方法

1.1材料与仪器

鸡蛋（大小均匀且无损伤的红壳鸡蛋），购于山东泰安批发市场；9 g/100 mL黑枣醋（多酚含量为0.164 mg/mL；初始pH为3.4），山东农业大学果蔬加工实验室发酵；甘氨酸、果糖（分析纯），北京索莱宝科技有限公司；茚三酮试剂（分析纯），上海科丰实业有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、无水乙醇、亚硝酸钠、碳酸钠、浓硫酸、浓硝酸、浓盐酸、氢氧化钠、氯化锌、氯化钙、氯化钠、三氯乙酸（分析纯），天津市凯通化学试剂有限公司；钼酸铵、无水亚硫酸钠、氯化亚铁、氯化铜、芦丁标准液（分析纯），上海源叶生物科技有限公司；氢氧化钾（分析纯），天津市科密欧化学试剂开发中心。

AX124ZH分析天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司；YP2003电子天平，上海光正医疗仪器有限公司；TG16台式高速离心机，长沙英泰仪器有限公司；平行蒸发仪，杭州嘉维创新科技有限公司；PB-10型pH计，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；PH-070A培养箱、磁力搅拌器，上海一恒科学仪器有限公司；101-2ES电热鼓风干燥箱，北京市永光明医疗仪器厂；HH-6数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；KQ2200DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1黑枣醋蛋液工艺研究（1）响应面试验优化黑枣醋蛋液生产工艺：通过Box-behnken试验设计原理，采用Design-Expert.V8.0.6.1，参照陈文璐等[13-14]研究，通过分析比较前人研究方法步骤，确定响应面试验变量为与试验联系最为密切的因素，参照杨萍芳[15]等的研究，研究其方法步骤，数据分析，确定选值范围，选取对黑枣醋蛋液影响显著的醋蛋比（A）、浸泡温度（B）、浸泡时间（C）3个因素，以蛋白质水解度（Y）为响应值，进行三因素三水平的响应面设计，将得到的试验结果进行回归方程拟合，得出最优醋蛋液工艺参数。试验过程均重复3次。响应面设计试验因素及水平见表1。

1.2.2黑枣醋蛋液蛋白质水解度稳定性影响因素研究（1）不同pH对黑枣醋蛋液蛋白质水解度稳定性的影响：称取红壳鸡蛋若干份，按醋蛋质量比3：1的比例分别添加9 g/100 mL黑枣醋，分别调节pH至3、5、7、9、11，在25 ℃的恒温培养箱中浸泡64 h，过滤，检测样品的蛋白质水解度。平行操作3次。（2）不同温度对黑枣醋蛋液蛋白质水解稳定性的影响：称取红壳鸡蛋若干份，按醋蛋质量比3：1的比例分别添加9 g/100 mL黑枣醋，分别在20、40、60、80、100 ℃条件下处理64 h，过滤，检测样品的蛋白质水解度。平行操作3次。（3）不同金属离子对黑枣醋蛋液蛋白质水解度稳定性的影响：称取红壳鸡蛋若干份，按醋蛋质量比3：1的比例分别添加9 g/100 mL黑枣醋，分别用钙、铁、锌、铜4种金属离子进行处理，每种金属离子浓度均为0、30、60、90、120 mmol/L，于25 ℃的恒温培养箱中处理64 h，过滤，检测样品的蛋白质水解度。平行操作3次。

1.2.3指标测定方法

（1）蛋白质水解度测定：参照赵新淮等[16]的方法。蛋白质水解度DH（%）=（浸泡后醋蛋液中游离氨基酸一浸泡前蛋液中游离的氨基酸）/鸡蛋中含有的所有氨基酸（鸡蛋液中的蛋白氮）×100（1）

（2）标准曲线的测定：精确称取0.100 0 g甘氨酸，加水溶解，转移至100 mL容量瓶中，定容，取出2.00 mL定容完毕的甘氨酸溶液。分别稀释，获得含量为0、4、8、12、16、20 μg/mL的溶液。分别取2.00 mL稀释液于试管中加入1.00 mL显色剂，混和均匀后放入水浴锅中，100 ℃沸水浴中加热15 min；取出后用冷水冷却，加入5.00 mL 40%乙醇溶液混合均匀，放置15 min使之反应，用零管调零，并测定其在570 nm处的吸光值。

（3）醋蛋液中游离氨基酸的测定：取醋蛋液10.00 mL定容至100 mL，取0.40 mL稀释液于试管中并加入1.6 mL蒸馏水、1.00 mL显色剂，混匀后置沸水浴中加热15 min，然后冷水冷却，加入5.00 mL 40%乙醇溶液混匀，放置15 min后用1 cm比色杯，以零管调零于570 nm处测定A值。利用标准曲线计算醋蛋液中游离氨基酸的含量。

1.3数据分析处理

试验采用 SPSS 18.0 软件进行数据分析，采用 Origin Pro 8.5 进行作图，采用 Design-Expert 10.0.1 软件进行响应面实验设计及分析。

2结果与分析

2.1黑枣醋蛋液加工工艺优化

（1）响应面试验结果与方差分析：以醋蛋比值（X₁）、浸泡时间（X₂）、浸泡温度（X₃）为自变量，以蛋白质水解度为响应值（Y），做响应面分析试验，试验设计及结果见表2。利用Design-Expert软件，采用 Box-BehnkenDesign 模型对数据进行统计分析，得到多项式回归方程：

醋蛋水解度=19.02+1.28A+0.53B+3C+0.025AB-0.73AC+0.37BC-2.72A²-3.37B²-1.57C² （2）

该二次项方程及各项方差分析如表3所示。模型P<0.01，模型极显著，失拟项P>0.05，失拟项不显著，说明该模型具有统计学意义。观察各因素的P值可以得出，因素A、C、A2、B2、C2对醋蛋水解度的影响极显著（P<0.01）；因素B及交互项AC对醋蛋水解度的影响显著（P<0.05）；其他变量的影响均不显著（P>0.05）；说明单因素作用和交互作用对醋蛋水解度均有显著的影响。校正系数R²_Adj=0.983 7，说明仅1.63%的变异不能被该回归方程解释；CV值为2.85，说明模型方程能够很好地反映真实的实验值。相关系数R²=0.992 9，由此可见，预测值与实际值之间具有高度相关性。因此该模型能够用于优化黑枣醋蛋液的浸泡工艺。

（2）各因素及其交互作用对醋蛋水解度的影响：响应面图形是通过二维空间和三维空间，直观地反应各因素及其交互作用对响应值的影响。从图1可以看出，各因素在醋蛋水解过程中的交互作用。等高线形状反映了各因素之间交互作用的强弱。等高线的变化趋势反应了各因素对醋蛋水解度的影响能力的强弱。通过等高线可以看出，AC、BC、AB其形状均为椭圆形，说明醋蛋比（A）、浸泡时间（B）、浸泡温度（C）对醋蛋水解度的影响复杂，各因素之间均有交互作用。且醋蛋比与浸泡温度的交互作用最显著。通过等高线的变化趋势可得，各因素对醋蛋水解度的影响的大小顺序为浸泡温度＞醋蛋比＞浸泡时间。这与方差分析结果一致。为进一步准确确定最优配方，以醋蛋水解度最高为优化目标，根据Design-Expert 10.0.1 软件运行结果，醋蛋水解度在醋蛋比、浸泡时间、浸泡温度的共同影响下的最佳条件为醋蛋质量比3.05 ∶1，浸泡时间60.52 h，浸泡温度29.72 ℃，在此条件下，模型预测的最大醋蛋水解度为20.54%。

（3）最优条件的验证试验：根据软件预测结果，结合实际工艺设置的可行性，取醋蛋质量比3 ∶1、浸泡时间60 h、浸泡温度30 ℃为条件进行3次重复试验，得平均醋蛋水解度为20.23%，与模型预测结果接近，表明基于该响应面模型分析优化黑枣醋蛋液浸泡工艺的方法有效可行。

2.2黑枣醋蛋液蛋白质水解度稳定性影响因素研究

2.2.1pH对水解度稳定性的影响黑枣醋蛋液浸泡过程中不同pH对醋蛋水解度的影响显著[17]。由图2a可知，pH 3～7范围内醋蛋水解度不断降低，这一阶段发生蛋白质的酸水解，且pH越低越有利于蛋白质水解。pH 7～11时，醋蛋水解度先升高后降低，在pH 9时达到最高，这一阶段发生蛋白质的碱水解。对比不同pH处理可知，当pH为3时最适合醋蛋水解，醋蛋液蛋白质水解度最高，可达22.6%。

2.2.2温度对水解度稳定性的影响由图2b可知，醋蛋液蛋白质水解度随温度的升高呈现先升高后降低的趋势。在处理温度15～25 ℃范围内，醋蛋水解度随着温度的升高而增大，在25～35 ℃范围内，随着温度的升高，醋蛋水解度不断降低，25 ℃时醋蛋水解度最高为20.0%。结果表明，25 ℃左右的温度处理有助于醋蛋液的醋蛋水解更充分。当温度过低时，醋蛋酸水解反应速度较慢，醋蛋水解程度较小；当温度过高时，蛋白质会发生变性，不利于醋蛋水解，同样使得醋蛋水解度比较小[18]。

2.2.3金属离子对水解度稳定性的影响由图2c可知，4种金属离子不同浓度对醋蛋液水解度影响不同。随着金属离子浓度的增加，醋蛋液水解度均呈现先上升后降低的趋势。亚铁离子、钙离子、锌离子、铜离子均在浓度为60 mmol/L时，醋蛋液水解度达到最高，分别为26.6%、28.2%、23.6%、23.0%。未经金属离子处理的醋蛋水解度最低，分别为18.6%、23.4%、18.6%、19.2%。4种金属离子处理的醋蛋液水解度均大于未被金属离子处理的醋蛋液水解度，这说明金属离子处理有助于醋蛋液蛋白质的水解。一方面，酸性环境下，鸡蛋中蛋白质发生水解使醋蛋液水解度增加；另一方面，亚铁离子、钙离子、锌离子、铜离子等不同金属离子处理，可能会改变鸡蛋中蛋白质分子间的一些作用力，如-OH、-NH₂的氢键可能因配位形成有利于醋蛋肽水解的物质，促进了醋蛋液中蛋白质水解[19-20]。综上所述，亚铁离子、钙离子、锌离子、铜离子对醋蛋液的处理对醋蛋水解度均有促进作用，且促进醋蛋液蛋白质水解程度为钙离子＞铁离子＞锌离子＞铜离子。