桑葚花色苷提取物对乙醇诱导的小鼠肝损伤和死亡率的影响

作者: 李文丽 周羽佳 杨丽丽

桑葚花色苷提取物对乙醇诱导的小鼠肝损伤和死亡率的影响0

摘要:目的:探讨桑葚花色苷提取物矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cy-3-G)对乙醇诱导的小鼠肝损伤和死亡率的影响。方法:将8w龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、酒精液体饲料喂养组以及酒精液体饲料喂养加Cy-3-G干预组。对照组喂食Lieber-DeCarli对照液体饲料,后两组喂食Lieber-DeCarli酒精液体饲料构建小鼠酒精性肝损伤模型,Cy-3-G以灌胃方式给予。观察肝脏组织病理学改变;检测肝脏总胆固醇(TC),血清天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT),及血清内毒素(LPS)等生化指标水平;检测肝脏促炎细胞因子白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和巨噬细胞趋化蛋白-1(MCP-1)水平;记录小鼠死亡情况。结果: 短期乙醇喂养使小鼠肝脏出现明显脂肪变性,肝脏TC,血清ALT、AST水平升高,而Cy-3-G干预缓解了乙醇诱导的小鼠肝脏脂肪变性,降低了小鼠肝脏TC,血清ALT、AST水平。与酒精组相比,Cy-3-G补充可以降低血清LPS水平,并进一步改善乙醇引起的肝脏炎症,降低IL-1βTNF-αMCP-1水平。长期过量乙醇摄入导致小鼠死亡率增加,而Cy-3-G干预明显降低小鼠死亡率。结论: 桑葚花色苷提取物Cy-3-G可以改善乙醇诱导的小鼠肝损伤,其保护机制可能是通过抑制LPS释放从而抑制肝脏炎症反应实现的。此外Cy-3-G还可以有效预防长期过量乙醇摄入导致的小鼠死亡,保护小鼠健康,提示Cy-3-G有望成为防治酒精性健康损害的有效措施。

关键词:矢车菊素-3-O-葡萄糖苷;花色苷;酒精性肝病;内毒素;NIAAA模型

除了限制饮酒外,目前,对于酒精性肝病(ALD)的治疗尚无特效药。特别是进展到后期,更多是采取对症治疗的方法。肝脏作为酒精代谢的主要器官,过量酒精摄入会给肝脏带来巨大负担,选择一种安全有效副作用小的防治策略势在必行。来自于食物中的生物活性成分有望成为防治酒精性肝病的潜在疗法。矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cy-3-G)广泛存在于深色蔬菜及水果中,是膳食花青素中最具代表性及含量最丰富的一种食物活性成分,具有强效的抗炎、抗氧化作用。Cy-3-G对非酒精性脂肪肝、肥胖、动脉粥样硬化及高血糖等代谢性疾病均具有保护作用[1-4]。本课题组既往研究也发现,在8w的酒精性肝炎及12w的酒精性肝纤维化模型中,Cy-3-G补充可以改善高脂及酒精长期联合喂养导致的小鼠肝损伤[5-6],但是Cy-3-G对于急性酒精性肝损伤的保护作用仍不明确。本研究通过构建短期及长期NIAAA模型(又称Gao-Binge模型)来全面探讨桑葚花色苷提取物Cy-3-G对短期或长期过量饮酒小鼠的健康保护效应,为酒精性肝病的防治提供一个新思路。此模型将慢性乙醇喂养与单次或多次大剂量乙醇灌胃相结合,更好的模仿了大多数酒精性肝病患者的饮酒模式,也是目前研究酒精性肝病较为公认且应用较广泛的动物模型。

1材料与方法

1.1试剂

Cy-3-G,从桑葚中提取,具体提取步骤参照[7];95%乙醇(中国,阿拉丁);Lieber-DeCarli标准型酒精液体饲料、Lieber-DeCarli对照液体饲料,中国,南通特洛菲;总胆固醇(TC)检测试剂盒,中国,普利来;天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒,中国,南京建成;内毒素检测鲎试剂盒(中国,厦门鲎试剂);Trizol,美国,Invitrogen;cDNA合成试剂盒、SYBR Green Supermix试剂盒,日本,Takara。

1.2动物分组与造模

所有动物实验均获得中山大学动物伦理委员会批准(2012-0080)。SPF级4W龄雄性C57BL/6J小鼠购自广东省实验动物中心,饲养于在中山大学公共卫生学院的SPF级动物房。环境温度维持在25℃,每天接受照明时间为12 h。

1.2.1短期NIAAA模型将8w龄小鼠随机分为3组:对照液体饲料喂养组(CTRL组,n=8)、酒精液体饲料喂养组(EtOH组,n=8)、酒精液体饲料喂养加Cy-3-G干预(EtOH+Cy-3-G组,n=8)。EtOH组和EtOH+Cy-3-G组给予Lieber-DeCarli标准型酒精液体模型饲料(5%V/V乙醇),CTRL组给予Lieber-DeCarli对照液体饲料[8]。使用液体饲料喂养3组小鼠10d;并于第11天清晨对EtOH组和EtOH+Cy-3-G组给予一次大剂量乙醇(5 g/kg BW)灌胃,CTRL组给予等热量麦芽糊精灌胃,8 h后处死。Cy-3-G每天以200 mg/kg BW进行灌胃,EtOH组和CTRL组用等体积生理盐水进行灌胃。各组小鼠干预期间实行等热量喂养,依据EtOH组进食情况来控制CTRL组饲料给予量。

1.2.2长期NIAAA模型将8w龄小鼠随机分为3组:对照液体饲料喂养组(CTRL组,n=9)、酒精液体饲料喂养组(EtOH组,n=12)、酒精液体饲料喂养加Cy-3-G干预(EtOH+Cy-3-G组,n=12)。EtOH组和EtOH+Cy-3-G组提供Lieber-DeCarli标准型酒精液体模型饲料(5%V/V乙醇),CTRL组给予Lieber-DeCarli对照液体饲料[8]。使用液体饲料喂养3组小鼠共4w,并于第7、14、21、28天清晨对EtOH组和EtOH+Cy-3-G组给予一次大剂量乙醇(5 g/kg BW)灌胃,CTRL组以灌胃方式给予等热量麦芽糊精,并于第28天大剂量乙醇灌胃8h后处死小鼠。Cy-3-G每天以200 mg/kg BW通过灌胃方式给予EtOH+Cy-3-G组小鼠,EtOH组和CTRL组小鼠用等体积生理盐水进行灌胃。各组小鼠干预期间实行等热量喂养,依据EtOH组进食情况控制CTRL组饲料给予量。

1.3肝脏切片H&E染色

小鼠使用戊巴比妥钠麻醉后,脱臼处死,解剖取肝脏组织,切取一小块肝脏组织迅速放入装有4%多聚甲醛的EP管中,室温保存。对肝脏组织进行石蜡包埋后,切成5~8 μm厚度均匀的薄片。脱蜡后将切片浸泡入苏木素染液中3~8 min对细胞核进行染色,清水冲洗15min。接下来将石蜡切片浸泡到伊红染液中1~3 min对细胞质进行染色,清水冲洗15 min。脱水处理后,在通风橱中使用中性树胶进行封片。使用显微镜进行切片观察并拍照保存。

1.4肝脏总胆固醇(TC)检测

小鼠使用戊巴比妥钠麻醉后,经眼眶取血,对小鼠实施脱臼处死后进行解剖,收集肝脏样本,分装并保存于-80℃冰箱中。取分装好的肝脏约30 mg,按1 mg组织20 μL组织裂解液的比例加入试剂盒提供的专用裂解液,使用高通量组织研磨仪制备肝匀浆。取肝匀浆严格按照普利来试剂说明对肝脏甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)进行检测。

1.5血清天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)检测

小鼠用戊巴比妥钠麻醉后,经眼眶取血,用无菌EP管收集血液,室温放置1 h后于4 ℃,3 000 r/min条件下离心30 min,取上清严格按照南京建成试剂盒说明对血清中天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)的活性进行检测。

1.6血清内毒素(LPS)检测

小鼠用戊巴比妥钠麻醉后,经眼眶取血,用无菌EP管收集血液,室温放置1 h后于4 ℃,3 000 r/min条件下离心30 min,取上清进行检测。具体检测步骤严格按照厦门鲎试剂内毒素检测鲎试剂盒说明进行操作。

1.7肝脏炎症因子检测

称取20 mg肝脏,使用Trizol从肝脏中提取总RNA。对提取的总RNA浓度及纯度进行检测后,使用cDNA合成试剂盒将1 μg RNA逆转录为cDNA。以β-actin为内参,采用SYBR Green Supermix试剂盒配置反应体系进行实时荧光定量PCR,检测白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和巨噬细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的相对表达量,并使用比较阈值周期(ΔΔCt)方法量化相对倍数变化。实验所用引物见表1。

1.8统计分析

使用GraphPad Prism 8.3.0和SPSS 26.0进行统计分析和绘图。采用单因素方差分析分析各组间定量数据的统计差异。使用卡方检验分析各组间定性数据的统计差异。数据表示为均数±标准误,P<0.05被认为具有统计学意义。

2结果与分析

2.1短期NIAAA模型中3组小鼠体重及日摄食量

在11d的短期NIAAA模型中,3组小鼠的平均体重与平均日摄食量在喂养期间没有统计学差异(P>0.05)(图1A、B),表明实验过程中在3组小鼠间严格执行了等热量喂养。

2.2短期NIAAA模型中Cy-3-G对小鼠肝脏组织的影响

肝脏组织病理切片的H&E染色结果显示,与CTRL组相比,EtOH组小鼠的肝细胞表现出弥漫性脂肪变,内部可见大小不等、数量不一的脂滴,并且肝细胞排列紊乱、肝索纹理不清,肝脏出现明显的炎性细胞浸润;而EtOH+Cy-3-G组肝细胞内脂滴数量显著减少,肝索纹理清晰呈放射状排列,肝脏炎性细胞浸润明显减轻,与CTRL组结构类似(图2A)。进一步对肝脏总胆固醇(TC)水平进行检测,结果显示,同CTRL组比,EtOH组小鼠肝脏TC水平升高(P<0.01),而EtOH+Cy-3-G组肝脏TC水平较EtOH组降低(P<0.05)(图2B),表明补充Cy-3-G对短期过量乙醇摄入引起的酒精性脂肪肝具有保护作用。

2.3短期NIAAA模型中Cy-3-G对小鼠血清中AST、ALT活性的影响

EtOH组小鼠血清中AST活性高于CTRL组(P<0.05),而EtOH+Cy-3-G组血清中AST活性较EtOH组降低(P<0.01)(图3A)。同样,乙醇喂养使得小鼠血清中ALT活性增加(P<0.05),而Cy-3-G有预防乙醇喂养引起的血清ALT活性增加的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)(图3B)。以上结果提示,补充Cy-3-G在一定程度上可以预防急性酒精性肝功能损伤。

2.4短期NIAAA模型中Cy-3-G对小鼠血清LPS的影响

过量饮酒会引起肠道功能损伤,一方面导致肠道菌群紊乱,另一方面使得肠道通透性增加,促使LPS等菌群副产物透过肠道屏障进入门静脉,加剧对肝脏的损伤[9]。因此,进一步对血清LPS水平进行检测。对比CTRL组,EtOH组小鼠血清LPS水平升高(P<0.01),EtOH+Cy-3-G组小鼠的血清LPS水平较EtOH组降低(P<0.01)(图4)。

2.5短期NIAAA模型中Cy-3-G对小鼠肝脏炎症因子的影响

LPS与Toll样受体4(TLR4)结合进一步激活Kupffer细胞产生各种炎症因子和趋化因子,引起肝脏炎症反应。EtOH组小鼠肝脏IL-1βTNFαMCP-1 mRNA水平较对照组明显升高(P<0.05),而Cy-3-G可以有效预防乙醇喂养引起的炎症因子IL-1βTNFαMCP-1 mRNA水平的升高(P<0.05)。图5结果表明,Cy-3-G补充可以明显改善乙醇喂养引起的小鼠肝脏的炎症反应。

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