AKK菌对高脂饲料诱导的肥胖大鼠糖脂代谢的影响

摘要：目的：探讨嗜粘蛋白阿克曼菌（AKK菌）对高脂饲料诱导的肥胖SD大鼠糖脂代谢相关指标的影响。方法：健康SPF级雄性SD大鼠，选取10只作为对照组，喂普通饲料;高脂饲料诱导肥胖大鼠模型，选取成功复制的肥胖大鼠20只，随机分为肥胖模型组和AKK菌干预组。对照组灌胃生理盐水，肥胖模型组灌胃不含AKK菌的混悬液，AKK菌干预组灌胃含1×10⁹CFU AKK菌的混悬液。每日灌胃1次，每次1 mL/kg。灌胃4 w后，3组动物分别测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）浓度，进行糖耐量试验[（空腹血糖（FPG）、餐后0.5 h血糖（0.5 hPG）、餐后1 h血糖（1 hPG）、餐后2 h血糖（2 hPG）]，测定血清胰岛素水平及空腹体重、肝脏重量及附睾脂肪重量;HE染色观察大鼠肝脏脂肪浸润情况及附睾脂肪细胞脂滴大小。结果：AKK菌灌胃4 w后，与肥胖模型组相比，大鼠肝脏重、肝指数（%）、FPG、1 hPG、2 hPG、血糖曲线下面积、TG、TC、LDL-C、AST、ALT水平均明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）;附睾脂肪重、体脂百分比、0.5 hPG和胰岛素水平均有下降趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）;HDL-C有升高趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）;HE染色观察显示，肝脏组织的脂肪浸润程度以及附睾脂肪细胞的脂滴面积均小于肥胖组模型组。结论：AKK菌可显著降低高脂饲料诱导的肥胖大鼠的体重、血糖血脂、转氨酶水平，可能通过提高大鼠胰岛素敏感性，改善其肝功能。

关键词：AKK菌;高脂饮食;肥胖;大鼠;糖脂代谢

肥胖与许多疾病的风险增加有关，包括糖尿病、心血管疾病和癌症等^[1-2]。通过减轻体重改善机体糖脂代谢，进而预防一系列相关慢性病并发症的发生，对提高人们生活质量及促进人类健康具有重大意义。近年来，由于测序及分析技术的进步^[3]，有关肥胖、代谢综合征与肠道菌群关系的研究也取得了较大的进展。嗜粘蛋白阿克曼菌（AKK菌）研究已涉及多种系统疾病，主要集中于代谢性相关疾病^[4]。本课题组前期研究发现，基线肠道微生物群作为个体减肥轨迹的预测指标优于其他因素，并发现AKK菌在瘦个体中显著富集，并且在节食期间它们的丰度增加^[5]。本研究通过高脂饲料诱导肥胖大鼠模型，进一步探讨AKK菌对高脂饲料诱导的肥胖SD大鼠糖脂代谢相关指标的影响，挖掘AKK菌可能在人类相关治疗中的应用价值。

1材料与方法

1.1实验动物

SPF级雄性SD大鼠，平均体重为（139.6±28.5）g，由中国医学科学院医学实验动物研究所提供，许可证号SCXK京2019-0008。

1.2饲料及AKK菌

1.2.1饲料普通饲料为AIN-93M饲料（蛋白质含量14.2%、产热比14.7%）;高脂饲料（蛋白质含量20%、产热比17%;碳水化合物含量50%、产热比43%;脂肪含量21%、产热比41%;胆固醇含量0.15%），均由中国医学科学院医学实验动物研究所提供。

1.2.2AKK菌AKK菌，德国DSMZ原装进口，由北京孚曼生物技术有限公司扩增并提供经低温离心后的高浓缩菌混悬液。

1.3主要试剂及仪器

生化指标由日本HITACHI-7100型全自动生化分析仪检测;甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）检测试剂盒，北京新创科兴科技有限公司;血糖仪及血糖试纸，雅培公司;胰岛素超敏试剂盒（CrystalChemInc.，Cat：90060），北京兰博利德商贸有限公司;台式高速冷冻离心机TGL-16，湘仪公司;万分之一电子天平（FA-N型），中国民侨公司;HE染色仪器为匈牙利3DHISTECH CaseViewer（Pannoramic SCAN），染色图像，武汉百仟度生物科技有限公司。

1.4方法

1.4.1肥胖模型建立健康SPF级雄性SD大鼠，选取10只作为对照组，喂饲普通饲料;其它作为高脂组，喂饲高脂饲料。大鼠饲养在24 ℃、湿度75%、12 h光照-黑暗循环的实验室中，自由饮水，自由采食配好的饲料。记录观察动物生长与进食情况。16 w后称量大鼠空腹体重，选择高脂组体重超过对照组大鼠平均体重10%的大鼠个体即为肥胖大鼠模型。

1.4.2动物分组选取成功复制的肥胖大鼠20只，随机分为肥胖模型组和AKK菌干预组，与对照组大鼠10只共3组，30只大鼠进行实验研究。

1.4.3干预方法对照组灌胃生理盐水;肥胖模型组灌胃不含AKK菌的混悬液;AKK菌干预组灌胃含1×10⁹CFU AKK菌的混悬液。灌胃1次/d，每次1 mL/kg，共灌胃4 w。

1.5观测指标

1.5.1体重及糖耐量实验干预结束后，大鼠禁食不禁水，12 h后测空腹体重，进行口服糖耐量（OGTT）实验。每只大鼠灌胃葡萄糖2 g/kg，采尾尖血测空腹血糖（FPG）、0.5 h血糖（0.5 hPG）、1 h血糖（1 hPG）、2 h血糖（2 hPG），并计算血糖曲线下面积（GAUS）。GAUS采用梯形面积进行计算，如式（1）：

GAUS=（FPG/4+0.5 h PG/2+1 hPG×3/4+2 hPG/2）×1 hmmol·h/L（1）

1.5.2组织重及血液指标禁食12 h，水合氯醛3 mL/kg麻醉后，腹主动脉采血，取肝脏、附睾脂肪垫等组织。用含促凝剂的真空采血管采血后，1 600 g/min离心15 min，取上清液并按试剂盒操作说明书测定ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C、胰岛素水平。将取得的肝脏、附睾脂肪垫用滤纸吸干组织液后用万分之一电子天平称重，并按式（2）、（3）计算肝指数及体脂百分比：

肝指数=（肝脏重量/大鼠体重）×100%（2）

体脂百分比=（附睾脂肪重量/大鼠体重）×100%（3）

1.5.3HE染色用福尔马林溶液固定肝脏及附睾脂肪组织，经石蜡包埋切片后用苏木素-伊红染色（HE），脱水封片后，用显微镜镜检采集图像：附睾脂肪HE染色切片于200倍显微镜下观察脂肪细胞脂滴大小，每张切片随机摄取10个视野;肝脏组织HE染色切片于400倍显微镜下观察脂肪浸润情况，每张切片随机摄取10个视野;并用Image-Pro Plus 6.0软件分析附睾脂肪细胞面积。

1.6数据处理及分析

数据用±s表示，采用SPSS 26统计软件包进行数据处理，采用单因素方差分析，方差齐时组间比较采用LSD法，方差不齐时组间比较采用Tamhane's T2法。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果与分析

2.1AKK菌对肥胖大鼠体重及肝脏重、脂肪重等的影响

由表1可见，研究开始时，3组大鼠体重无显著性差异（P>0.05），研究具有可比性。喂养高脂饲料16w后，肥胖模型组大鼠体重显著增加（P<0.05）。AKK菌干预组灌胃4w后，体重显著下降，与肥胖模型组比较有统计学意义（P<0.05）。进一步比较3组大鼠的肝脏重及肝指数，AKK菌干预组显著低于肥胖模型组，具有统计学意义（P<0.05）。附睾脂肪重及体脂百分比有下降趋势，但AKK菌干预组与肥胖模型组之间没有显著性差异（P>0.05）。

2.2AKK菌对肥胖大鼠糖代谢相关指标的影响

由表2可见，3组大鼠FPG、1 hPG 、2 hPG 、GAUS，AKK菌干预组均显著低于肥胖模型组，有统计学意义（P<0.05），但0.5 hPG和胰岛素水平3组之间没有显著性差异（P>0.05）。

2.3AKK菌对肥胖大鼠脂代谢相关指标的影响

表3可见，3组大鼠的血脂指标（TG、TC、LDL-C）及肝功能的2项转氨酶指标（AST、ALT），AKK菌干预组均显著低于肥胖模型组，有统计学意义（P<0.05）。AST、TC、LDL-C甚至低于对照组（P<0.05）。3组之间HDL-C没有显著性差异（P>0.05）。

2.4肥胖大鼠肝脏及脂肪组织HE染色结果

由图1可看出，与对照组比较，肥胖模型组大鼠的脂肪组织细胞体积增大，细胞壁变薄;而AKK菌干预组较肥胖模型组大鼠脂肪组织细胞明显缩小;用Image-Pro Plus 6.0软件分析附睾脂肪细胞面积（图2），对照组（1.21±0.18×1 000 μm²）、肥胖模型组（3.52±0.23×1 000 μm²）及AKK菌干预组（1.39±0.21×1 000μm²），AKK菌干预组附睾脂肪面积小于肥胖模型组（P<0.05）。由图3所示，与对照组比较，肥胖模型组大鼠肝脏组织内脂肪细胞明显增多，空泡变大，而AAK菌干预组较肥胖模型组大鼠肝脏组织内脂肪细胞明显减少，白色空泡数量减少。故AKK菌干预组肝脏脂肪浸润明显小于肥胖模型组。

3讨论

通过用高脂饲料喂养SD大鼠来诱导其肥胖，建立肥胖常用动物模型，是本课题组研究与肥胖相关疾病的常用动物模型。本课题组前期通过预实验确定本次研究AKK菌的干预浓度，结果显示，1×10⁹CFU/d浓度的AKK菌对高脂饲料诱导的肥胖大鼠具有降低体重、降低血脂、血糖、胰岛素敏感性、改善肝功能指标等作用，

与相关研究^[6-8]结果具有一定的一致性，进一步验证了AKK菌在改善肥胖糖脂代谢紊乱中的有益作用。

Remely等^[9]纳入无胰岛素抵抗的肥胖患者，以营养干预的方式减轻体重，当体重减轻后AAK菌的定植水平随之回升;本课题组前期研究也发现，AKK菌在瘦个体中显著富集，并且在节食期间丰度增加^[5]。因此AKK菌在肥胖的发生、发展过程中发挥重要作用，对其机制的深入研究将为肥胖的治疗提供新的策略。据报道，AKK菌对宿主代谢生理的代谢活性也已确定与几种脂质代谢物质直接相互作用，包括改变内毒素水平^[10]、短链脂肪酸（SCFA）生成^[11]以及增加肠道和脂肪组织中的脂肪酸氧化^[12]，这些代谢物会对葡萄糖和脂质体内平衡产生影响。本实验组相关炎症指标、肠屏障功能及转录因子在检测中，相关数据有待进一步分析。尽管相关研究达到了大多数的主要结果，但该领域尚处于早期阶段，且其研究对象多局限于动物，在人体的安全性仍缺乏更多的数据的支持^[13]。

另一方面，本课题组对研究中大鼠的肠道菌群风度也进行了相关测定，后续将与其糖脂代谢指标的变化进行进一步分析。随着研究的深入，AKK菌有很大的实力成为潜在靶点以改善肥胖、抵抗糖尿病、抑制肝脏疾病和心脑血管系统紊乱引发的疾病等，为预防和治疗疾病提供新方向^[14]。

参考文献

[1]World Health Organization.Obesity and Overweight.World Health Organization.Available online：https：//www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/obesity-and-overweight（1 November 2021）.