油莎草提取物对慢性应激诱导小鼠抑郁样行为的改善和作用机制初探
作者: 敬思群 陈菲 叶俊 刘根梅 张俊艳
摘要:目的:研究油莎草提取物对慢性温和不可预见性应激(CUMS)小鼠的抗抑郁功效及机制。方法:采用 CUMS 程序持续6 w建立抑郁模型,造模成功后,随机将小鼠分为模型组、阳性组、油莎草须根水提物剂量组、油莎草须根醇提物剂量组、油莎草地上茎叶水提物剂量组、油莎草地上茎叶醇提物剂量组、油莎豆水提物剂量组、油莎豆醇提物剂量组,每组14只。灌胃给药,持续30 d,模型组和正常组灌胃等体积的双蒸水,阳性组氟西汀按20 mg/(kg·d)BW灌胃,其余6组皆按200 mg/(kg·d)BW灌胃。除正常对照组外,其余组均采用CUMS小鼠模型,并观察油莎草提取物对小鼠行为学、生化指标和皮质酮等指标的影响。每周进行体重称量,采用旷场实验、强迫游泳实验、糖水偏好实验等行为学方法评价小鼠的抑郁状态;采用试剂盒法测定小鼠血清MDA 含量、SOD、GSH-PX 活性等生化指标,采用酶联免疫分析(ELISA)法测定小鼠血清皮质酮含量。结果:与正常组比较,模型组小鼠生长缓慢,运动功能明显受到抑制,小鼠水平、垂直运动得分降低(P<0.01),游泳不动时间明显延长,糖水相对消耗量明显降低(P<0.01);血清SOD、GSH-Px活性降低,MDA含量明显增高(P<0.01),皮质酮水平明显升高(P<0.01);与模型组比较,油莎草提取物各组小鼠生长正常,小鼠水平、垂直运动得分提高(P<0.01),游泳不动时间显著缩短(P<0.01),蔗糖水相对消耗量明显升高(P<0.01);血清 SOD、GSH-Px活力提高,MDA 含量明显降低(P<0.01),小鼠血清皮质酮水平明显降低(P<0.01);与正常组比较无统计学差异。结论:油莎草提取物对慢性应激所引起的抑郁症状有一定的改善功效,其作用机制可能与抑制HPA轴功能紊乱,改善机体自由基损伤状态,增强 SOD 、GSH- Px活力,降低 MDA含量等多种途径有关。
关键词:油莎草提取物;抗抑郁作用;行为学;生化指标;皮质酮水平
抑郁症是发病率最高的精神疾病,具有高患病、高复发、高致残和高致死率等特点[1-2]。目前,治疗抑郁症的药物多数是化学合成,因此从天然产物中开发出疗效更好、副作用更低的抗抑郁药物成为当务之急[3]。植物化学物因其天然、高效、低毒等特点,已成为治疗抑郁症的研究热点[4-6]。目前发现的具有抗抑郁作用的天然活性物质有黄酮类、生物碱类、多糖类、皂苷类、苯并二蒽酮类等[7]。WANG J C等[8]发现,葫芦巴种子类黄酮可能通过下调KLF11/SIRT1-MAO-A通路,抑制MAO-A的表达和活性,以及上调单胺类神经递质水平发挥抗抑郁作用;孙丹晨等[9]通过网络药理学方法,以抑郁症为目的疾病,筛选出酸枣仁生物碱中10 个具有抗抑郁的活性成分;韦震等[10]研究发现,黄精多糖(200、400 mg/kg)可通过上调急性绝望抑郁模型动物脑内的单胺类神经递质、抑制神经炎性反应和调节色氨酸代谢通路起到改善抑郁的作用;张云等[11]研究发现,柴胡皂苷D通过PI3K/AKT/FOXO1信号通路抑制TLR4蛋白表达,改善大鼠脑中神经炎症与神经元凋亡,逆转LPS造成的大鼠抑郁样症状;肖东[12]采用慢性不可预知性小鼠抑郁模型及分子生物学技术研究发现,苦豆根单体黄酮Trifolirhizin及总黄酮能显著改善小鼠的抑郁样症状。
油莎草是莎草科莎草属多年生草本[13],是一种优质、高产、综合利用价值高的多用型作物[14]。《新华本草纲要》及《名医别录》里有油莎草行气开郁功效的记载,而抑郁症在中医上多属“郁证”[15]。研究发现,油莎草具有促进微循环和抗凝血活性作用[16],能够调节大鼠的性行为[17]、干预缺血性脑中风[18]等生物活性,但关于油莎草抗抑郁生物活性的研究鲜见报道,而其同属莎草科植物的香附子根的醇提物、香附挥发油抗抑郁作用已有研究报道。JIA H M等[19]发现,香附醇提物乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位对“行为绝望”动物模型有较明显的抗抑郁作用,其作用机制是抑制了5-羟色胺单胺递质(5-HT)的再吸收以及单胺氧化酶(MAO活性);李世英等[20]采用慢性束缚应激法建立小鼠焦虑模型。通过强迫游泳实验、悬尾实验、旷场实验、明暗箱实验、高架十字迷宫实验分析发现香附挥发油能改善慢性束缚应激小鼠焦虑行为,其作用机制可能与调节中枢胆碱能系统、增加海马单胺类递质 5-HT 水平有关。
敬思群等[21]对油莎草全株三部位活性成分的分析结果表明,油莎草含有糖类、黄酮、内酯、香豆素及其苷类、甾体及三萜类、鞣质与酚类、生物碱、强心苷等有效成分。Jing SQ等[17]研究发现,油莎草地上茎叶醇提物及其总黄酮活性单体荭草苷对CoCl2诱导的HT22细胞I/R损伤有保护作用。荭草苷是一种具有生物活性的黄酮类化合物,且有研究报道荭草苷能抑制氧化应激、改善Aβ1-42诱导的阿尔茨海默病小鼠认知功能缺陷[22]。王赛赛等[23]确定了油莎草地上茎叶醇提物的30%乙醇洗脱部位为抗氧化活性最强部位,并从此部位分离得到4个单体化合物,其中荭草苷占4种单体总量的65.4%(质量百分比),荭草苷是油莎草单体化合物的主要组成部分。鉴于此,本研究采用慢性不可预见性的应激(CUMS)小鼠抑郁模型,通过小鼠行为学测试、血清超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)含量等生化指标、血清皮质酮水平分析,考察油莎草三部位提取物的抗抑郁作用,为抗抑郁候选新药的研发及油莎草资源深层次开发利用奠定理论基础。
1材料与方法
1.1材料与仪器
SPF级健康雄性ICR小鼠[生产许可证号:SCXK(新)2016-0003]162只,6~8 w龄,体重(20±2)g。动物质量合格证号:110322201101520028。动物于屏障级 SPF动物房饲养盒内常规饲养,自由进食进水;油莎草,采自实验室在新疆昌吉的试验田,2017年9月;丙二醛(MDA)试剂盒(货号A001-1)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(酶活150.50 U/mL,货号A003-1)、谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-PX)测试盒(酶活69.12 U/mL,货号A005),南京建成生物工程研究所;酶联免疫试剂盒(ELISA),上海将来实业股份有限公司;盐酸氟西汀(阳性对照药),礼来苏州制药有限公司(批号:8373A)。
Multifuge X1R离心机,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;SHE-3000G全波长多功能酶标分析仪,北京海尔福知心科技有限公司;隔水式恒温培养箱,上海一恒科技有限公司;RE-52旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂;DZF-6050真空干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司;LGJ-25C冷冻干燥机,四环福瑞科仪科技发展(北京)有限公司。
1.2方法
1.2.1样品制备(1)醇提物的制备:各部位的粉末过60目筛,分别以95%乙醇和50%乙醇各回流提取2次,每次2 h。提取液抽滤后,减压浓缩(温度40 ℃、真空度0.01 MPa),冷冻干燥(真空度1 Pa、冷阱温度65 ℃)。(2)水提物的制备:各部位的粉末过60目筛,用蒸馏水回流提取3次,每次2 h。提取液抽滤后,减压浓缩(温度80 ℃、真空度0.01 MPa),冷冻干燥(参数同上)。
1.2.2造模、分组及给药(1)建立慢性不可预见性温和应激(CUMS)抑郁小鼠模型:参照薛剑方法[20]。CUMS期间需单笼饲养,给予充足的水和食物,应激刺激方法有:①向每个标准笼喷洒干净的水使垫料潮湿,将动物放置在潮湿笼中3~4 h;②45°斜笼3~4 h;③2 h昼/12 h夜循环为每30 min 1个连续周期,持续8 h;④移除所有垫料并加入0.25英尺深度的水,持续时间4 h;⑤噪音刺激等3 h以上刺激,前3周每天1种,后面可酌情增加应激,持续6 w,造模成功。具体为:领取小鼠162只,分2个组(空白组和模型组),空白组正常饲养18只,模型组开始持续6 w的抑郁症模型建立,将造模组小鼠进行模型达标测试,淘汰不合格的小鼠。再将造模组小鼠按照抑郁症模型测试结果随机分组,每组14只,即模型组、阳性组、油莎草须根水提物剂量组、油莎草须根醇提物剂量组、油莎草地上茎叶水提物剂量组、油莎草地上茎叶醇提物剂量组、油莎豆水提物剂量组、油莎豆醇提物剂量组。(2)分组:造模成功后,开始给小鼠受试药物4 w(模型组,一部分在测试过程中继续应激模型,另一部分不继续应激)。实验前对SPF级ICR小鼠进行1次糖水偏爱度实验,根据结果选取无显著差异的小鼠分别称取体重。实验前1天进行旷场实验,剔除中央活动总路程结果差异较大的小鼠,然后将健康雄性小鼠112只随机分为8组,每组14只,分别为正常对照组和模型组(均灌胃给予等体积的蒸馏水)、阳性对照组(盐酸氟西汀40 mg/kg)和试验样品干预组(实验组分别为油莎草须根水提物、油莎草须根醇提物、油莎草地上茎叶水提物、油莎草地上茎叶醇提物、油莎豆水提物、油莎豆醇提物)(表1)。(3)给药:将小鼠按照组别分笼饲养,每天灌胃1次,灌胃容积 0.1 mL/10 g BW,给药组(C~I 组)按照设定剂量灌胃受试物,A组和B组灌胃等体积的纯净水,连续给药30 d,第30天晚上10点禁食,第31天处死小鼠,取样。
1.2.3指标测定(1)体重称量,按给药后,每周进行体重称量,持续30 d。(2)小鼠行为学测试:①旷场实验:采用木质敞箱(50 cm×50 cm×50 cm),周壁及底面均为黑色,底面划分为面积相等的25个方格(10 cm×10 cm),观察5 min内小鼠的活动情况,包括自主活动次数(方格间穿行次数)、直立次数(两前肢离地1 cm以上的次数)。②强迫游泳实验:正式测试前24 h,将小鼠置水深23 cm的玻璃圆缸(高40 cm,直径18 cm)内,水温(24±1)℃,作强迫游泳训练15 min。在末次给药60 min后再次将小鼠置水深23 cm的玻璃圆缸内强迫游泳5 min,观察并记录5 min内小鼠的静止时间。当小鼠停止挣扎,浮在水中保持不动,或仅做一些必要的轻微动作保持头部浮在水面上的时间视为不动时间。③糖水偏好试验:先训练动物适应饮糖水,训练每笼同时放2个小瓶,1个瓶装2%蔗糖水,1个瓶装纯水,每12 h换1次瓶子位置。训练结束后进行糖水偏好实验,先禁食禁水8 h,再给予每笼小鼠事先称过重量的2瓶水(1瓶2%蔗糖水,1瓶纯水),15 h(中途8 h时交换瓶子位置)后,取走2瓶并称重,计算糖水消耗量、纯水消耗量,再算出小鼠糖水的偏好百分比。小鼠糖水的偏好百分比=糖水摄入量(g)/[糖水消耗量(g)+纯水消耗量(g)],正常组作对照。在造模期间每2周测1次糖水偏好值,操作步骤同上。(3)生化指标测定:①小鼠血清MDA含量测定和SOD及GSH-PX活性测定:各组小鼠进行完行为学测试后,摘眼球取血,分离血清。测定MDA含量、SOD和GSH-Px的活性,按照试剂盒规定的方法比色测定吸光度,按公式换算成SOD和GSH-Px的活性以及MDA浓度。②小鼠血清皮质酮浓度测定:采用酶联免疫分析(ELISA)法测定皮质酮含量,操作步骤按照皮质酮试剂盒说明书进行。
1.3数据分析
数据均以均数±标准差(x±s)表示,由SPSS 统计软件进行分析,以P<0.05 为差异有统计学意义。
2结果与分析
2.1油莎草提取物对CUMS小鼠体重的影响
由表2可知,与正常组比较,模型组小鼠体重降低,有厌食暗示;与正常组比较,各给药组小鼠体重增加,无显著性差异;与模型组比较,各给药组小鼠体重增加明显,差异具有统计学意义(油莎草须根水提物和醇提物剂量组;油莎豆水提物组剂量组)。结果表明,油莎草提取物可以改善抑郁症小鼠的厌食程度。
2.2油莎草提取物对CUMS小鼠行为学的影响
2.2.1对CUMS小鼠旷场运动行为的影响由表3可知,造模前8组小鼠水平运动得分对比差异均无统计学意义(P>0.05),造模后,正常组水平运动得分与模型组和7个给药组比较有显著性差异(P<0.01),垂直运动得分也有显著性差异(P<0.05或P<0.01),说明本研究造模成功。与正常组比较,各给药组小鼠水平运动和垂直运动得分无显著性差异(P>0.05)。与正常对照组比较,模型组小鼠的运动功能明显受到抑制,水平和垂直运动得分低;与模型组比较,各给药组中,油莎草须根水和醇提物、油莎草块茎水提物组和油莎豆醇提物剂量组水平运动得分提高,说明油莎草须根水和醇提物、油莎草块茎水提物和油莎豆醇提物对CUMS小鼠的行为有一定的影响,对抑郁症小鼠有改善水平活动行为的作用。油莎草须根水和醇提物组垂直运动得分提高,这说明油莎草须根水和醇提物对CUMS小鼠的行为有一定的影响,对抑郁症小鼠有改善垂直运动行为的作用。综上,油莎草提取物可以改善抑郁症小鼠的运动能力,以油莎草须根水和醇提物作用最强。