柱前衍生化高效液相色谱法分析大鼠体内D-丝氨酸和L-丝氨酸

摘 要：目的：建立柱前衍生化高效液相色谱紫外检测法分析大鼠血浆和脑组织中D-丝氨酸和L-丝氨酸的方法，比较对照组与缺硒组大鼠血浆和脑组织中D-丝氨酸和L-丝氨酸含量的差异，研究D-丝氨酸和L-丝氨酸与硒缺乏的关系。方法：衍生化试剂：邻苯二甲醛和N-乙酰-L-半胱氨酸，衍生温度为室温，反应时间为5 min。采用Waters X bridge Amide 色谱柱（250 mm × 4.6 mm，3.5 μm），进行梯度洗脱，流速1.0 mL/min、柱温30 ℃、检测波长340 nm。结果：D-丝氨酸和L-丝氨酸分别在2～14 μg/mL和8～56 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数（R2）分别为0.999 6、0.999 4，加样回收率为97.29%～101.88%。结论：该方法快速灵敏，可用于大鼠体内D-丝氨酸和L-丝氨酸含量的测定。对照组和缺硒组大鼠血浆中L-丝氨酸含量有显著性差异。

关键词：D-丝氨酸;L-丝氨酸;高效液相色谱法;硒

D型氨基酸主要位于哺乳动物的大脑皮层、海马和外周组织中，被认为是重要的生物标志物[1-2]。D-丝氨酸（D-Ser）是中枢神经系统中N-甲基-D-天冬氨酸受体的重要内源性配体，由L-丝氨酸（L-Ser）经丝氨酸消旋酶转化而来[3]。D-Ser是一种神经递质，参与突触传递、突触可塑性等生理功能的调节，与N-甲基-D-天冬氨酸受体功能障碍相关的神经系统疾病有密切关系，如阿尔兹海默症、神经分裂症、抑郁症等[4]。内源性D-Ser水平的变化是当前神经生物学研究的热点，因此研究并建立内源性D-Ser高效灵敏的检测方法对疾病预防和治疗、临床医学、神经生物学研究等具有重大意义。

大多数氨基酸不具有紫外或荧光信号，氨基酸分析仪通过柱后衍生可一次性检测多种氨基酸，但不能区分不同构型的氨基酸。生物体内的L-Ser含量丰富，D-Ser含量较低，且含有大量肽、胺类物质以及氨基酸，给D-Ser的检测带来诸多干扰，目前常用的方法有毛细管电泳法、手性高效液相色谱法和酶分析方法，但这些方法均有缺点[5-10]。本研究建立了以邻苯二甲醛（OPA）和N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）衍生化高效液相色谱分离紫外检测的分析方法，具有操作简单、价格低、灵敏度高、适用性好等优势，可作为神经科学研究的有效技术和方法。此外，应用该方法测定了对照组和缺硒组大鼠血浆和脑组织中D-Ser和L-Ser含量，探究D-Ser和L-Ser与硒缺乏的关系，并可能为神经系统疾病的防治提供新的临床诊断手段。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1260型高效液相色谱仪、DAD紫外检测器，美国安捷伦公司;BS210S电子天平，德国赛多利斯科学仪器（北京）有限公司;DELTA 320 pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;多样品组织研磨仪，上海贺帆仪器有限公司;OPA、NAC，上海麦克林生化科技有限公司;D-Ser、L-Ser，Sigma-Aldrich公司;甲醇，色谱级，Merck公司;硼砂、醋酸铵，天津市康科德科技有限公司。

1.2 溶液的配制

1.2.1 标准溶液的配制 分别精密称取D-Ser 、L-Ser 各0.050 0 g，用超纯水溶解并稀释到50 mL，配制成1 mg/mL的储备溶液。

1.2.2 衍生化试剂溶液的配制 分别精密称取OPA 0.050 0 g、NAC 0.050 0 g，用5 mL甲醇溶解，加入20 mL 0.1 mol/L的硼砂缓冲液（pH 9.8）混合均匀，使用前配制。

1.3 方法

1.3.1 动物实验 3 w龄断乳雄性Sprague-Dawley大鼠10只，体重（48.3±5.9）g，采购于三峡大学实验动物中心，生产许可证号为SCXK（鄂）2017-0012。将大鼠分为缺硒组（SD组，n=5）、对照组（SS组，n=5），缺硒组饲喂低硒饲粮（含0.02 mg Se/kg饲粮），正常组饲喂正常饲粮（含0.18 mg Se/kg饲粮）。低硒饲粮按照AIN-93标准配制，正常饲粮是在低硒饲粮的基础上添加亚硒酸钠制成。大鼠饲养环境温度为（20±2）℃，相对湿度为55%～65%，自由饮食。

1.3.2 样品收集 实验至第532天，缺硒组和对照组各取5只大鼠，眼静脉丛取血0.5 mL，置于肝素钠抗凝的离心管中，1 520×g条件下离心10 min，分离上清得到血浆;大鼠断头后迅速在冰盘上分离大脑皮质、海马，将样本于-80 ℃保存，用于后续D-Ser和L-Ser含量的测定。

1.3.3 样品处理与衍生化反应 （1）血浆：将360 μL甲醇加入到40 μL血浆中，涡旋5 min，8 100×g条件下离心10 min，取上清液350 μL在氮气下吹干，加入70 μL新鲜配制的衍生化试剂，涡旋反应5 min后于8 100×g条件下离心5 min，取上清液10 μL进样测定。（2）脑组织：精密称取0.050 0 g脑组织，加入1 mL甲醇，冰浴条件下组织匀浆，匀浆液在8 100×g条件下离心10 min，取上清液400 μL氮气下吹干，加入100 μL超纯水涡旋反应5 min后于8 100×g条件下离心5 min，取上清液40 μL，加入40 μL新鲜配制的衍生化试剂，涡旋反应5 min后于8 100×g条件下离心5 min，取上清液10 μL进样测定。

1.3.4 液相色谱条件 色谱柱：Xbridge Amide column（250 mm × 4.6 mm，3.5 μm）;流动相：A：50 mmol/L醋酸铵，B：乙腈;流速：1.0 mL/min;柱温：35 ℃;检测波长：340 nm;进样量：10 μL;洗脱梯度见表1。

2 结果与讨论

2.1 系统适用性实验

在上述衍生化条件和色谱条件下，D-Ser 和L-Ser得到很好地分离，如图1所示，皮质样品中D-Ser和L-Ser的分离度大于1.5，说明该色谱条件适合样品中D-Ser与L-Ser含量分析。

2.2 线性关系和定量下限

分别用储备液配制D-Ser和L-Ser混合标准品溶液，即D-Ser为 4、6、12、18、22、28 μg/mL系列标准溶液;L-Ser为16、24、48、64、80、112 μg/mL系列标准溶液。分别取各标准溶液50 μL与等体积衍生化试剂衍生化后测定。以峰面积为纵坐标（Y）、标准品溶液的浓度为横坐标（X），绘制标准曲线。分别得到D-Ser和L-Ser的回归方程为：Y=14.946X-18.496（R2=0.998 2）、Y=12.339X-44.555（R2=0.999 4）。结果表明，D-Ser在2～14 μg/mL的范围，L-Ser在8～56 μg/mL范围内具有良好的线性关系。以10倍信噪比计算定量限，D-Ser和L-Ser的定量限为0.04 μg/mL。

2.3 稳定性

NAC-OPA衍生化法的一个缺点是衍生产物存在不稳定性，以峰面积评价稳定性发现，衍生化产物在30 ℃条件下4 h内稳定性良好。低温可以延长衍生产物的稳定性[11]，在4 ℃条件下12 h内稳定性良好。

2.4 回收率

冰浴条件下制备脑组织提取液，分别加入不同浓度水平的L-Ser和D-Ser的标准品，衍生化并离心分离后进样测定。每个浓度3个样本，计算方法回收率，结果见表2。方法回收率为97.29%～101.88%，相对标准偏差小于5.87%。

2.5 精密度

冰浴条件下制备脑组织提取液，分别加入240 μg/mL的L-Ser和60 μg/mL的D-Ser的标准品10 μL，加入50 μL衍生化试剂，涡旋反应5 min后8100×g离心5 min，取上清液置于液相小瓶中，进样检测峰面积。重复衍生化反应及后续步骤，测定6次，计算得到峰面积的RSD值为1.63%和1.83%，表明精密度良好。

2.6 方法学应用

用上述建立的方法检测对照组和缺硒组大鼠血浆、大脑皮质和海马组织中D-Ser和L-Ser含量。结果如图2所示，与对照组相比，缺硒组大脑皮质和海马中D-Ser和L-Ser含量无明显差异，血浆中L-Ser含量显著升高（P<0.05），L-Ser含量无显著变化。血浆中L-Ser含量有可能与硒缺乏有关。

3 结论

本研究建立了NAC-OPA柱前衍生化法反相液相色谱紫外检测测定大鼠血浆和脑组织中D-Ser和L-Ser的方法，该方法快速、灵敏、专属性好、检测时间短、应用范围广。经方法学验证该方法的精密度、稳定性、线性关系、加样回收率均良好，适用于动物血浆和脑组织中D-Ser和L-Ser的同时检测，为硒缺乏与神经系统疾病的进一步研究提供方法学参考。

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