高效液相色谱法测定保健食品中七烯甲萘醌的含量

维生素K2是一种脂溶性维生素，天然存在于动植物体内，是结构相似的一系列物质的总称。其中，七烯甲萘醌（MK-7）是指侧链含有七个双键的维生素K2类化合物，也是活性最高、功能最强的维生素K2化合物。MK-7在人体内参与骨代谢，具有预防骨质疏松的功效，还能诱导肝癌、胃癌、肺癌、骨肉瘤等癌细胞凋亡，具有较好的抗癌功效。市场监督管理总局于2016年发布的205号公告将MK-7收录于保健食品原料目录，批准采用发酵法生产的MK-7可作为保健食品的维生素K来源，适用于所有人群，每日允许摄入量为15—100μg。当前市售的维生素K2保健食品较多，但食品安全国家标准检验方法体系框架内暂时没有保健食品维生素K2的配套方法。市售保健食品中以添加反式结构MK-7为主，本实验旨在找到一种准确、稳定、高精密度、操作简单的高效液相色谱法，用于检测保健食品中的反式MK-7含量。

1. 仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪，配荧光检测器（FLD）/二极管阵列检测器（DAD），U3000，美国赛默飞世尔；数控超声波清洗器，KQ2200DETB，昆山市超声仪器有限公司；涡旋仪，Vortex-Genie2，美国Scientific Industries公司；离心机，SF-TDL-4A，上海菲恰尔；恒温振荡箱，THZ-98AB，上海一恒科学仪器有限公司；色谱柱：SB-C18色谱柱，250mm*4.6mm，5μm，880975-902，美国安捷伦；锌粉还原柱：50mm*4.6mm，LAAA-0002-01，上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 材料

七烯甲萘醌，MK-7，含量：99.5%，USP挪威；异丙醇，色谱纯，北京迪马科技；甲醇，色谱纯，北京迪马科技；四氢呋喃，色谱纯，北京迪马科技；冰醋酸，分析纯，上海凌峰；无水乙酸钠，分析纯，上海凌峰；氯化锌，分析纯，上海凌峰；无水乙醇，分析纯，上海凌峰；碳酸钾，分析纯，上海凌峰；实验用水为超纯水。

2. 实验与方法

2.1 七烯甲萘醌（MK-7）标准储备液配制

准确称取MK-7标准品（CAS No：2124-57-4）10mg，用异丙醇溶解并转移至100mL棕色容量瓶中，再用异丙醇定容至刻度。标准储备液浓度为100μg/mL。

2.2 样品前处理

固体片剂样品均匀研磨成粉状，胶囊样品取内容物混合均匀，液体口服液样品混合均匀。精密称取1g样品至10mL棕色容量瓶中（用变性淀粉或糊精包埋过的样品先加0.01mol/L盐酸溶液1.0mL，涡旋混匀后超声10min破包埋；含油脂的软胶囊样品加脂肪酶0.2g，加水2.0mL，涡旋混匀后于37℃恒温振荡箱酶解4h以上），加异丙醇约5mL，涡旋混合至样品分散，超声提取30min，中间超声处理10min后，取出手动摇匀1次。超声完成后，取出放至室温，用异丙醇定容至刻度，摇匀，离心，取上清液过膜上机。

2.3 上机测试色谱条件

采用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（250mm*4.6mm，5μm，880975-902），上海安谱生产的锌粉还原柱（50mm*4.6mm，LAAA-0002-01）。流动相配制：甲醇900mL、四氢呋喃100mL、冰醋酸0.3mL、氯化锌1.5g和无水乙酸钠0.5g混合均匀，超声脱气30min备用。流动相上机流速为1.0mL/min，等度洗脱。采用FLD检测，激发波长（EX）为243nm，发射波长（EM）为430nm，色谱柱柱温为30℃，进样量10为μL。

2.4 标准曲线的绘制

精密移取MK-7标准储备液0.5mL至100mL棕色容量瓶中，用异丙醇溶解并定容至刻度，摇匀，此中间液浓度为0.5μg/mL。分别精密移取0.00、0.50、1.00、2.00、5.00mL中间液至10mL棕色容量瓶中，用异丙醇溶解并定容至刻度，摇匀，取中间液作为曲线最高点。MK-7标准曲线系列溶液的浓度分别为0.000、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500μg/mL，各取10μL，按照上述色谱条件上机测试，记录色谱图峰面积，以标准溶液浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

3. 结果与分析

3.1 实验条件优化

3.1.1 前处理优化。原卫计委《关于海藻酸钙等食品添加剂新品种的公告（2016年第8号）》附件3方法中的测试基质为维生素K2（发酵法）油剂产品与粉剂产品，此类基质为生产MK-7保健食品的原料。本研究参照原卫计委方法中的样品前处理方式，采用异丙醇超声提取30min后过膜上机，色谱峰分离度较好，峰形对称良好，MK-7测试值能达到样品理论添加量的90%以上，复现性较好，偏差不超过10%。同时，本实验前处理还参考了GB 5009.290-2023《食品安全国家标准 食品中维生素K2的测定》中的提取方式，样品经脂肪酶、淀粉酶在37℃恒温箱酶解2h以上，加入10mL无水乙醇及1.0g碳酸钾，混匀后分2次（每次10mL）加入正己烷20mL，振荡提取10min，再离心分层，合并正己烷层至100mL旋蒸瓶中，旋蒸至干，用流动相复溶，混匀后过膜上机，色谱峰分离度较好，峰形对称良好，但MK-7测试值偏低，不到理论添加量的80%，且复现性较差，偏差在30%以上。因此，前处理确定采用异丙醇超声提取的方式，操作简单，测试结果符合理论预期，复现性较好。

3.1.2 高效液相色谱上机条件优化。本实验对比了原卫计委《关于海藻酸钙等食品添加剂新品种的公告（2016年第8号）》附件3、GB 5009.290-2023《食品安全国家标准 食品中维生素K2的测定》、GB 5009.158-2016《食品安全国家标准 食品中维生素K1的测定》第一法的上机条件。第一种方法的上机测试条件是：采用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱，流动相为纯甲醇，流速为1.0mL/min，等度洗脱，DAD检测，波长为254nm，柱温为50℃，进样量为20μL。通过验证，此方法的定量限为10μg/g。目前实验室检测过的各种保健食品中MK-7含量为0.6-360μg/g，因此原卫计委方法中的上机条件不适用于低含量保健食品的检测。维生素K1、维生素K2在国标方法中的上机测试条件是：色谱柱、流动相、流速、柱温、进样量参照上述色谱条件，采用FLD检测，维生素K1的EX为243nm、EM为430nm，维生素K2的EX为326nm、EM为410nm。两种方法除了检测波长不一样，其余色谱条件都一样。表1统计对比了同一浓度的MK-7标准溶液在不同波长下检测到的色谱峰峰面积，由此可知，在EX为243nm、EM为430nm检测波长下，MK-7响应最好。

3.2 方法线性范围及定量限

MK-7标准曲线回归方程为Y=1040879X（R2=0.9999），MK-7在0.00—0.50μg/mL与色谱峰峰面积呈正相关。称取1.0g维生素K口服液空白样品至10mL棕色容量瓶中，共10份，每份添加0.25μg的MK-7，进行样品处理后上机测试，计算样品中的MK-7含量。计算10个空白样品加标含量的标准偏差SD，分析方法的检出限（LOD）为3SD对应的待分析物含量，定量限（LOQ）为10SD对应的待分析物含量。结果显示，方法检出限为0.0408μg/g，定量限为0.136μg/g。根据实验室测试经验，大部分保健食品的MK-7含量在0.6—360μg/g，故此方法定量限能够满足同类产品的定量测试需求。

3.3 精密度与耐用性

称取6份维生素K口服液阳性样品、6份维生素K咀嚼片阳性样品各1.0g至10mL棕色容量瓶中，进行样品处理后，检测样品的MK-7含量，计算其相对标准偏差RSD值，口服液为2.18%，咀嚼片为1.21%，详见表2。取1号、2号口服液样品溶液进行0.9、1.0、1.1mL/min不同流速上机测试的耐用性试验，计算其RSD值为3.85%；取1号、2号口服液样品溶液进行28、30、32℃不同柱温上机测试的耐用性试验，计算其RSD值为3.01%；取1号口服液样品溶液进行0、8、16、24h不同存放时间后的上机测试耐用性试验，计算其RSD值为1.24%。以上数据说明，本分析方法具有良好的精密度与耐用性。

3.4 准确度

称取维生素K口服液空白样品9份各1.0g至10mL棕色容量瓶中，平均分成3组，每组3个样品，分别向每组添加0.5、1.0、1.5μg的MK-7标准物质，进行样品处理后，检测样品中MK-7加标回收率。结果显示，回收率范围为94.4%—99.6%，RSD值为1.82%，说明本方法的准确度较好。

综上所述，本方法准确度高、精密度高、耐用性好，能够满足绝大部分市售保健食品中七烯甲萘醌含量的检测需求。不过，目前本方法只能检测CAS号为2124-57-4的反式结构MK-7，对于其异构体（CAS：27670-94-6）则会在目标位出现五指峰。用变性淀粉或糊精包埋处理的样品需要添加盐酸溶液破包埋，含油量高的样品则需要用脂肪酶酶解后再进行下一步操作。同时，因为MK-7对光敏感，所以整个操作过程必须严格避光。

作者简介：张霞（1983—），女，汉族，重庆人，工程师，大学本科，研究方向为食品中维生素含量的检测。