鱼油重复给药毒性试验研究

鱼油是一种从多脂鱼类中提取的油脂，具有较好的营养保健等功能，在我国属于新资源食品。作为新型膳食补充剂，鱼油在备受追捧的同时，其安全性也一直存在争议。本试验对大鼠重复给样毒性试验进行研究，对鱼油的安全性进行再评价。

一、材料与仪器

1.供试品。鱼油，1kg/瓶，批号：133082009001，人体推荐食用量为1.2g/日/人，山东新华制药股份有限公司提供。根据该公司提供的质检报告，鱼油中DHA（二十二碳六烯酸）含量为85%、EPA（二十碳五烯酸）含量为0.829%。

2.实验动物。SPF级SD大鼠（购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司），实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0013，饲养于湖南普瑞玛药物研究中心有限公司屏障环境，实验动物使用许可证号：SYXK（湘）2020-0015。

3.主要仪器。ME2002E/02型电子天平（梅特勒-托利多仪器）；ME1002E型电子天平（梅特勒-托利多仪器）；AR223CN型电子天平（奥豪斯仪器）；KJ8B型直接检眼镜（苏州工业园康捷医疗器械有限公司）；BC-5000Vet兽用五分类血液细胞分析仪（深圳迈瑞公司）；LABOSPECT003型自动生化分析仪（日本日立公司）。

二、实验与方法

1.90天经口毒性试验方法。（1）剂量设置及分组给药。选用检疫合格的SD大鼠120只（SPF级），雌雄各半，按性别、体重随机分为溶媒对照组和鱼油低、中、高剂量组，溶媒对照组卫星组、鱼油高剂量组卫星组，每组20只。受试样品低、中、高剂量分别设为2.0、3.0、4.6g/kg·bw（分别相当于成人推荐食用量的100、150、230倍）。每周称重，并根据体重变化调整给样量，溶媒对照组给予同等剂量花生油，每天一次，连续给样90d。

（2）一般临床观察。实验期间所有动物单笼饲养，自由摄食摄水，每天观察并记录大鼠的一般表现、行为活动和生长情况等。

（3）体重及摄食量。所有大鼠前4周每周称重两次，4周后每周及解剖前称重一次，每周加食两次，记录加食量、撒食量和剩余量，计算每周平均摄食量及总摄食量，根据体重增重计算大鼠每周及总食物利用率。食物利用率（%）=体重增重（g）/摄食量（g）×100%。

（4）眼科检查。在试验前及试验中期、末期、恢复期，分别对溶媒对照组及受试样品高剂量组大鼠进行眼科检查（角膜、晶状体、球结膜、虹膜）。

（5）尿液、血液学及血液生化学指标。采集尿液，观察尿液外观，用尿液分析仪测定尿液相关指标；禁食不禁水16h后采用异氟烷吸入麻醉，腹主动脉采血，采用BC-5000Vet兽用五分类血液细胞分析仪测定血液学、凝血相关指标；非抗凝血分离血清，用LABOSPECT003型自动生化分析仪测定血液生化学相关指标。

（6）大体解剖观察及组织病理学检查。试验中期（第46天）、末期（第90天）、恢复期（第118天）禁食不禁水16h后采血，然后处死动物，解剖并进行大体解剖观察及组织病理学检查。称量各组织器官重量，计算脏/体比值。

2.试验数据统计。采用SPSS 22.0进行统计分析，P≤0.05具有统计学意义。用Leven’s test方法检验方差齐性，如果没有统计学意义（P>0.05），用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析；如果有统计学意义（P≤0.05），用LSD-t或Dunnett-t检验进行比较分析。

三、结果与分析

1.一般临床观察及体重。试验期间，各组动物生长发育良好，与溶媒对照组比较，试验末期雄性大鼠受试样品高剂量组第1-7周体重均明显减轻；其余各检测时间点各剂量组平均体重均未见统计学差异。

2.摄食量、体重增重及食物利用率。与溶媒对照组比较，雌性大鼠鱼油高剂量组第4-8、10-13周摄食量及总摄食量明显增加，中剂量组第10-11周摄食量明显增加；雄性大鼠鱼油高剂量第1周摄食量明显降低，第10-13周摄食量明显增加，中剂量组第11周摄食量明显增加。高剂量卫星组雌、雄性大鼠试验中期第6周摄食量明显增加；高剂量卫星组雌性大鼠试验末期第5、9、12、13周摄食量明显增加，雄性大鼠第4、5、6、11周摄食量和总摄食量明显增加；高剂量卫星组雄性大鼠恢复期第1周摄食量明显增加。

与溶媒对照组比较，受试样品高剂量组雄性大鼠第1、3周体重增重明显降低；试验中期受试样品高剂量卫星组雄性大鼠第6周体重增重明显增加；试验末期受试样品高剂量卫星组雌性大鼠第9周体重增重明显增加，第1周体重增重明显降低，雄性大鼠第3周体重增重明显降低；恢复期受试样品高剂量卫星组雄性大鼠第3周体重增重与总体重增重均明显增加。

与溶媒对照组比较，雌性大鼠鱼油高剂量组第1周食物利用率明显降低；雄性大鼠高剂量组第1、3周食物利用率及总食物利用率均明显降低，低剂量组第3周食物利用率明显降低。试验中期高剂量组卫星组雄性大鼠总食物利用率明显降低。试验末期高剂量组卫星组雌性大鼠第1周食物利用率与总食物利用率均明显降低，第9周食物利用率明显增加，卫星组雄性大鼠第3、4、6、13周食物利用率与总食物利用率均明显降低。恢复期高剂量组卫星组雄性大鼠第3周食物利用率与总食物利用率均明显增加。

3.血液学及血液生化学指标。如表1、2所示，与溶媒对照组比较，试验末期雌性大鼠低剂量组Neu、PT明显升高，Lym明显降低。中剂量组Bas明显升高；高剂量组Neu、Bas明显升高，Lym明显降低。雄性大鼠低、中、高剂量组Neu明显升高；中剂量组RBC、Lym明显降低；高剂量组Eos明显升高、Lym明显降低。试验中期高剂量组卫星组雌性大鼠Neu明显升高、Lym明显降低；恢复期高剂量组卫星组雌性大鼠WBC、APTT明显升高，雄性大鼠Bas明显升高。

如表3、4所示，与溶媒对照组比较，试验末期雌性大鼠低剂量组ALP明显升高、CHO明显降低；中剂量组Na+明显升高、CHO明显降低；高剂量组CHO明显降低。雄性大鼠低剂量组ALB明显升高，CHO、TG、Cl－明显降低；中剂量组AST明显升高、CHO、TG、Na+明显降低；高剂量组ALT、BUN、Cl－明显升高，CHO、TG、Na+明显降低。试验中期高剂量卫星组雌性大鼠CHO、Na+明显降低，雄性大鼠TP、ALB、BUN明显升高，CHO明显降低。恢复期高剂量组卫星组雌性大鼠ALB明显升高、K+明显降低、ALP明显降低，雄性大鼠TP、GLU明显降低。

4.尿液指标。与溶媒对照组比较，试验末期雄性大鼠中、高剂量组pH明显升高、SG明显降低，其余各剂量组各尿液指标均未见统计学差异。

5.眼科指标。给样前所有纳入试验的动物及试验结束后试验组和卫星组（溶媒对照和高剂量）大鼠的眼睑、结膜、角膜、虹膜、瞳孔、巩膜、晶状体、玻璃体及眼底等均未见明显异常。

6.脏器湿重及脏/体比值。如表5、6所示，与溶媒对照组比较，试验中期雌性大鼠高剂量组卫星组脑湿重明显升高。试验末期雌性大鼠受试样品低、中剂量组卵巢湿重明显升高，中剂量组胸腺湿重明显降低；雄性大鼠受试样品高剂量组心脏湿重明显降低；其余各剂量组动物脏器湿重均未见统计学差异。

如表7、8所示，与溶媒对照组比较，试验末期雌性大鼠中剂量组的卵巢脏/体比值明显升高、胸腺脏/体比值明显降低；雄性大鼠中剂量组的脾脏脏/体比值明显升高。试验中期雌性大鼠高剂量组卫星组肾脏脏/体比值明显升高。恢复期雌性大鼠高剂量组卫星组肾上腺脏/体比值明显升高。其余各剂量组动物脏/体比值均未见统计学差异。

7.大体解剖观察及组织病理学检查。肉眼观察各剂量组动物各送检组织均未见明显异常，各剂量组各解剖动物胸、腹腔无积液、无异物和肿瘤等，各脏器的解剖学位置正常。综合大体解剖观察及显微镜观察结果，试验中期、试验末期和恢复期解剖的鱼油高剂量组动物与溶媒对照组动物相比，病变数量与病变程度均未见明显差异，故不考虑与受试样品毒性相关。由此判定，本次检查未发现鱼油90天经口给样对SD大鼠有毒性意义的病理改变。其余各剂量组各脏器未见明显异常病变。

四、讨论

本实验室条件下，鱼油高、中、低剂量组连续给样90天，试验期间各组动物生长发育良好，未出现明显毒性反应和死亡，各异常指标数值均在本实验室历史参考值范围内，且各异常指标雌、雄性大鼠变化不一致，无明显剂量关系，无临床毒理学意义。大体解剖观察和组织病理学检查未见脾脏、肾脏等相关联脏器有明显异常病变，故认为上述差异与受试样品的毒性作用无关，不具有临床毒理学意义。综上所述，鱼油对SD大鼠的未观察到有害作用剂量（NOAEL）为4.6g/kg（约相当于人体推荐食用量的230倍）。

同时在实验数据中，实验末期雌性大鼠低、中、高剂量组CHO均明显降低；雄性大鼠低、中、高剂量组CHO、TG均明显将低，且TG呈剂量依赖性，结合实验过程中给样组大鼠均有不同程度的体重降低，故本实验结果认为鱼油对降低血脂确实有一定作用，其他研究者的实验结果也证实了鱼油的这一功效。