基于多糖、三萜、氨基酸含量的灵芝质量评价和品种分类模型的建立

灵芝（Ganoderma lucidum）是一种多孔菌科真菌灵芝的子实体，主要分布于浙江、福建、广东、吉林、黑龙江等地。灵芝富含多种活性成分，包括多糖、三萜、生物碱、氨基酸、核苷、呋喃、甾醇等，具有提高免疫力、抗肿瘤、降血糖、抗衰老等功效。2021年，国家卫生健康委员会、国家市场监督管理总局联合发布公告，把灵芝列入既是食品又是中药材的物质进行试点管理，这意味着灵芝的保健价值进一步被认可，市场需求进一步增大。

丽水是浙江省的灵芝核心区，拥有“中华灵芝第一乡”的称号，2010年、2011年，“龙泉灵芝”“龙泉灵芝孢子粉”分别被列为国家地理标志保护产品。因市场准入门槛低、掺假成本低、获利高等原因，在生产销售规模不断扩大的同时，丽水市的灵芝产业面临着产品质量参差不齐、以次充好、缺乏有效的质量评价技术等问题。因此，建立科学、有效的灵芝质量评价和品种分类方法，使评判可量化、易操作、更科学，对灵芝产业的健康、稳步发展具有重要的意义。

近年来，对灵芝开展质量评价和品种分类研究渐成热点，主成分分析、因子分析、聚类分析等统计手段已被广泛应用于产品品质关键指标筛选和质量综合评价研究。比如，姜涛等利用主成分分析比较了灵芝中5种重金属元素的差异，从而进行质量评价；袁晓艳等基于HPLC图谱共有峰，利用聚类分析进行了分类；范蕾等基于UPLC-MS/MS开展了灵芝三萜类多指标成分测定并进行质量评价；林冬梅等利用主成分分析，基于水溶性浸出物、灵芝多糖肽、灵芝酸、灵芝甾醇、单糖组成开展了质量评价；鞠瑞鑫等利用熵权逼近理想解排序法，对不同来源灵芝中的多糖、甾醇、三萜类等9种成分开展了综合评价。目前来看，尚无基于多糖、三萜、氨基酸含量的灵芝质量评价和品种分类的相关报道。

本研究以多糖、三萜、氨基酸含量为指标，利用因子分析和聚类分析建立了一套灵芝的质量评价和品种分类模型，为灵芝的资源评价、品种选育提供了参考和思路。

1. 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要仪器与试剂。U-3900紫外可见分光光度计，日本日立公司；AL104万分之一电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；L-8900全自动氨基酸分析仪，日本日立公司；Milli-Q Integral 5超纯水机，美国密理博公司；FD-53烘箱，德国BINDER；HH-4恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司；SD46-1智能电热板，天津拓至明实验仪器设备有限公司；3-30K高速低温离心机，德国Sigma公司。

齐墩果酸标准品，C30H48O3，纯度96.5%，坛墨质检科技有限公司；葡萄糖标准品，C6H12O6，纯度99.99%，上海麦克林生化科技股份有限公司；氨基酸混标，TPE5586，包括天冬氨酸Asp、苏氨酸Thr、丝氨酸Ser、谷氨酸Glu、脯氨酸Pro、甘氨酸Gly、丙氨酸Ala、缬氨酸Val、甲硫氨酸Met、异亮氨酸Ile、亮氨酸Leu、酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe、组氨酸His、赖氨酸Lys、精氨酸Arg、半胱氨酸Cys共17种，浓度均为2.50μmol/mL，日本日立公司；香草醛、冰醋酸、高氯酸、乙酸乙酯、乙醇、硫酸、蒽酮、盐酸，均为分析纯；MCI缓冲溶液；L-8500-pH试剂盒、茚三酮显色液试剂盒，日本日立公司。

1.1.2 样品。采集丽水地产灵芝8份共6个品种，其中“沪农1号”分别采集了3个不同产地的样品，该6个品种基本涵盖了丽水地区的所有灵芝品类。选取当季已成熟待采收的灵芝为样品，每份样品以梅花布点法在大棚中选取采集点，采集4-5个大棚，每份样品采集5kg，具体信息见表1。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理。将采集到的新鲜灵芝洗净，于50℃烘箱中干燥48h。每份干燥后的样品用研磨仪充分碾磨，混匀后制成混合样，过40目尼龙筛，采用四分法缩分至500g左右备用。

1.2.2 多糖检测。精密称取约1.0g样品粉末于圆底烧瓶中，加入50mL超纯水，称重，沸水浴加热回流提取5h，放冷，用水补足减少的重量，摇匀、过滤。取5.0mL续滤液，加入无水乙醇45mL，摇匀，冷藏沉淀过夜。10000r/min离心20min，弃去上清液，加入80%乙醇5.0mL涡旋震散，10000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀用热水溶解定容至20.0mL。精密称取葡萄糖标准品，用水配置成0.10mg/mL的标准溶液，备用。精密量取标准溶液和样品溶液，加入1g/L蒽酮硫酸溶液6.0mL，摇匀，在沸水浴中加热10min后取出，立即置于冰浴冷却15min，取出，于625nm比色测量。

1.2.3 三萜检测。精密称取约2.0g样品粉末于具塞锥形瓶中，加乙醇50.0mL，超声处理45min。过滤后，将滤液置于100.0mL容量瓶中，用适量乙醇分次洗涤滤器和滤渣，洗液并入同一容量瓶中，加乙醇至刻度，混匀。精密称取齐墩果酸标准品，用甲醇配置成0.20mg/mL标准溶液，备用。分别取标准溶液和样品溶液，置于15mL具塞试管中，挥干、放冷。精密加入新配制的50g/L香草醛冰乙酸溶液0.2mL、高氯酸0.8mL，摇匀，在70℃水浴中加热15min，立即置冰浴中冷却5min，取出，精密加入乙酸乙酯4.0mL混匀，于546nm比色测量。

1.2.4 氨基酸检测。精密称取约0.20g样品粉末于水解管中，加入6.0mol/L的HCl溶液5.0mL，氮吹维持8min，管口密封后于110℃水解22h，取出冷却至室温，用超纯水定容至100.0mL，混匀。取1.0mL滤液于10mL比色管中，真空干燥，加入1.0mL超纯水复溶，过0.22μmPTFE滤膜后，用氨基酸分析仪进行测定。

1.2.5 质量控制。每份样品均进行平行双样检测，每组实验重复3次，并随机挑选1份样品进行加标实验，以保证数据结果的准确性。

1.3 质量评价和品种分类模型的建立方法

所有数据均以“平均值±标准差”表示，采用Microsoft Office Excel 2007进行数据整理。

采用SPSS 22.0进行描述性分析、非参数检验、相关性分析、因子分析和聚类分析。利用因子分析，以多糖、三萜和16种氨基酸为变量指标，探索变量指标之间的相关性，提取出少数几个关键、独立又可反映变量之间内部关系的公因子，并按照各因子的权重计算出综合得分，建立质量评价方法模型。利用聚类分析，以多糖、三萜和16种氨基酸为变量指标进行系统自动分类，建立品种分类模型。

2. 结果与分析

2.1 检测结果

多糖在0.02-0.15mg时线性良好，相关系数为0.9994，低（0.02mg）、中（0.05mg）、高（0.10mg）3种加标水平下，样品的加标回收率为94.2%-106.7%，相对标准偏差为1.6%-4.8%（n=6）。三萜在0.02-0.10mg时线性良好，相关系数为0.9990，低（0.01mg）、中（0.03mg）、高（0.06mg）3种加标水平下，样品的加标回收率为89.1%-102.4%，相对标准偏差为3.6%-6.8%（n=6）。16种氨基酸（半胱氨酸除外）在0.02-0.25μmol/mL时线性良好，相关系数均大于0.999，低（0.02μmol/mL）、中（0.08μmol/mL）、高（0.15μmol/mL）3种加标水平下，样品的加标回收率为80.5%-105.7%，相对标准偏差为1.1%-5.7%（n=6）。

8份样品的多糖、三萜和氨基酸检测结果见表2和表3。对8份丽水地产灵芝的多糖、三萜、氨基酸结果进行正态性检验，其中三萜、Glu、Met、Ile、Phe、Lys、His7个指标的数据不呈正态分布（P＜0.05）。采用Kruskal-Wallis H检验对8份样品的18个指标开展非参数检验，采用Mann-Whitney U检验开展两两比较。Kruskal-Wallis结果显示，除Asp（P=0.075）、Leu（P=0.100）、Phe（P=0.060）外，其余15个指标在样本间均存在显著性差异（P＜0.05）。

多糖的含量范围为0.234-2.60g/100g，变异系数为54.88%，样品间差异明显。8份样品中，7号样品“沪农1号”和2号样品“龙芝2号”的多糖含量最高，5号样品紫芝最低，与姜涛等得出的赤芝多糖含量高于紫芝这一结论一致。

三萜的含量范围为0.538-0.917g/100g，变异系数为22.48%，样品间存在较大差异。8份样品中，3号样品“113”和7号、8号、6号样品“沪农1号”的三萜含量最高，4号样品“佳宝2号”最低，与姜涛等得出的三萜含量范围基本一致。

16种氨基酸的总量范围为2.92-5.10g/100g，其中，Tyr的变异系数最大，为66.72%，是本次检测的所有指标中的最大值，说明其在样品间差异显著。8份样品中，5号样品紫芝的氨基酸含量最高，8号样品“沪农1号”含量最低。

2.2 质量评价模型

采用Spearman相关系数对18个指标进行相关性分析，结果见表4。由表4可知，各指标之间均存在一定的相关关系。18个指标中，Gly的相关性最广，除多糖外，与其他16个指标均存在显著相关性，其次为Pro、Glu、Asp、His。多糖的相关性最少，与其他17个指标均不存在相关性。相关性较高的指标包括Glu-Ala、Glu-Lys、Glu-His、Gly-Ala、Gly-Pro、Lys-His以及Lys-Arg（r＞0.8，P＜0.01）。

相关性结果表明，8份样品的原始数据存在信息重叠，KMO=0.530（＞0.5），Bartlett球形度检验X2=499.790，P＜0.001，故可选择因子分析对上述18个指标进行简化降维，将各指标数据进行无量纲标准化处理后，筛选出具有代表性的综合变量，得出质量评价模型。

为更准确地开展分析，以特征值大于1且方差贡献率累计大于85%的标准，共提取出6个有效成分，具体结果见表5。其中，第1公因子F1主要反映Ser、Met、His、Lys、Glu、Gly、Leu、Ala等8项指标，方差贡献率为36.643%，起主导作用，正向作用指标占多数；第2公因子F2主要反映三萜、Arg和Phe，方差贡献率为16.916%，三萜呈较大的负向载荷权数，但整体正向作用指标多于负向作用指标；第3公因子F3主要反映Asp和Ile，正向作用指标占多数，方差贡献率为9.241%；第4公因子F4主要反映多糖，方差贡献率为9.214%，虽然多糖呈较大的负向载荷权数，但整体正向作用指标多于负向作用指标；第5公因子F5主要反映表Thr，方差贡献率为8.811%；第6公因子F6主要反映Tyr，方差贡献率为8.639%。

由成分得分系数矩阵表可得出6个公因子的成分得分方程：

F1=0.118X1+0.030X2-0.019X3-0.104X4+0.312X5+0.078X6+0.107X7+0.085X8+0.062X9+0.260X10-0.070X11+0.108X12+0.012X13-0.215X14+0.112X15+0.113X16+0.006X17+0.103X18

F2=-0.525X1+0.032X2-0.215X3-0.094X4-0.285X5+0.073X6-0.037X7+0.052X8+0.203X9-0.215X10+0.001X11+0.003X12-0.016X13+0.288X14+0.091X15+0.042X16+0.253X17-0.085X18

F3=0.246X1+0.060X2+0.609X3-0.097X4-0.274X5+0.170X6+0.165X7-0.187X8-0.325X9+0.150X10+0.486X11-0.170X12-0.253X13+0.226X14-0.127X15+0.133X16+0.126X17+0.099 X18