牛乳中乳过氧化物酶活性影响因素的研究

牛乳作为人类饮食结构中不容忽视的重要部分，不仅富含优质蛋白质、脂肪、维生素和矿物质，还含有诸多生物活性物质，其中最具代表性的物质就是乳过氧化物酶。乳过氧化物酶（英文：Lactoperoxidase，EC1.11.1.7，缩写为LP）普遍存在于动物乳汁中，是一种具有催化双氧水（H）分解功能的过氧化物酶，其分子结构中含有血红素基团，因此是一种具有独特抗菌性的血红素蛋白。在牛乳中，乳过氧化物酶与双氧水和硫氰酸根（SCN）共同组成乳过氧化物酶体系（英文：Lactoperoxidase System，简称LPS），具有强大的抑菌活性。

牛乳的采集环境、储存以及加工过程比较特殊，很容易受到微生物污染，导致牛乳品质下降甚至引发食品安全问题。目前，市场上主要采取热处理的方法对牛乳进行灭菌，包括低温长时间灭菌法（如BASDERS灭菌法）、高温短时间灭菌法以及超高温瞬时灭菌法等。但在热处理过程中，过高的温度或过长的时间均可能对牛乳中的生物活性成分尤其是乳过氧化物酶造成不利影响，进而影响乳品的整体品质。

乳过氧化物酶活性的测定方法较多，基于颜色反应和分光光度计测定的方法操作简单、结果准确，因而得到广泛应用。本实验通过分析不同的处理工艺（如不同温度和时间的热处理）和贮藏条件（如温度和时间），揭示了牛乳中乳过氧化物酶活性的影响因素，以期为乳制品加工工业提供理论依据和技术支持。

1. 材料与设备

1.1 材料与试剂

牛乳，GM乳业东兴牧场；二水合磷酸二氢钠，国药集团化学试剂有限公司；磷酸二氢钾，国药集团化学试剂有限公司；过氧化氢溶液，长沙化学试剂公司；2，2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸），郑州杰克斯化工有限公司；去离子水，CIVINWANG-广州和为医药科技。

1.2 仪器与设备

TE612-L电子天平，青岛骏源设备有限公司；BPS-1000CA隔水式恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；Avanti J-301高效离心机，美国Beckman Coulter有限公司；pH计，上海雷磁仪器有限公司；Specord 205紫外分光光度计，德国耶拿分析仪器股份公司。

2. 实验与方法

2.1 配置缓冲溶液

将二水合磷酸二氢钠0.72g、磷酸二氢钾3.99g加水450mL溶解，控制其pH在6.00±0.02，充分混合均匀后放置于500mL的烧杯中，再用去离子水定容。

2.2 配制过氧化氢溶液

取质量分数为0.3的过氧化氢溶液100µL，置于容量为100mL的烧杯中，用去离子水定容。

2.3 配制二、二铵盐（ABTS）溶液

取2，2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）55mg，加入缓冲溶液30mL，再将配置好的双氧水溶液1mL与其融合，然后用缓冲溶液定容。

2.4 测定牛乳中乳过氧化酶活性在不同杀菌过程中所受的影响

取3份牛乳原料，分别加热至75、85、125℃，保持温度15s进行杀菌处理，再进行低温陶瓷膜过滤，过滤后存放在冰箱中备用。随后做准备，测定不同杀菌过程对乳过氧化物酶活性的影响。

2.5 测定牛乳浓缩或脱脂过程中乳过氧化物酶活性所受的影响

取2份相同的原料牛乳，分别采用蒸发浓缩和离心脱脂，再采用75℃、15s的热处理，冷藏备用。后续分别对2份原料牛乳进行测定，对样品中的乳过氧化物酶进行蒸发浓缩和脱脂工艺处理，并测定活性。

2.6 研究牛乳中乳过氧化物酶的贮藏温度和时间对其活性的影响

取3份相同质量的原料牛乳，首先在75℃下热处理15s，然后将其分别置于5、20、30℃三种不同温度条件下。在各温度下，将原料牛乳样再分为9等份，分别放置0、5、15、30、60、90、120、240h，准备后续测定乳过氧化物酶的活性。

2.7 牛乳样品稀释液的制备

取待测牛乳样品，使其静置至室温。取原料牛乳取1份，加40倍水稀释；取鲜牛乳1份加20倍水稀释；取高温灭菌乳和超高温灭菌乳各1份，后两种样品不做稀释处理。

2.8 牛乳中乳过氧化物酶活性的测定方法

计算牛乳中乳过氧化物酶活力的公式如下：

其中，V1为待测体积总和；V2为牛乳样品体积；ε为摩尔吸光系数；d为比色皿的路径长度；n为稀释倍数；1000为换算系数，此式中为定值；2为化学计量系数，也为定值。

实验时先取2，2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）溶液2mL，再在比色皿中滴入取样，进行25℃水浴。加入50μL稀释牛乳样本，充分搅拌使之均匀混合。在分光度测量仪上再次快速放入混合液，在波长为420nm的吸光度处，测定时间分别为15s和2min，记录其值A1和A2。

2.9 计算乳过氧化物酶在牛乳中的活性损失率

乳过氧化物酶在牛乳中的活性损失率计算公式如下：

其中，a1表示牛乳中乳过氧化物酶活力；a2表示经过不同工艺处理后样品中乳过氧化物酶活力。

3. 结果与分析

3.1 不同杀菌过程中乳过氧化物酶的活性

实验发现，牛乳样本在75℃加热15s后，经过低温陶瓷膜过滤处理，乳过氧化物酶活性仍保持在较强水平；在85℃加热15s后绝大多数失去活性；125℃加热15s后则几乎全部失去活性。经过低温陶瓷膜过滤处理的牛乳汁，其过氧化酶活性在几种处理方法中损失最小，具体数据详见图1。

3.2 经浓缩或脱脂工艺后牛乳中乳过氧化物酶的活性

由表1、图2、图3可以看出，牛乳样品在不同贮藏温度、贮藏时间下，其乳过氧化物酶的活性变化相对较大。温度越高，贮藏时间越长，则乳过氧化酶活性损失越多，甚至会出现变质的情况。

综上所述，本文通过系统的实验设计，深入探究了不同热处理条件下，不同灭菌方式对牛乳中乳过氧化物酶活性的影响。

首先，乳过氧化物酶的活性受到热处理温度的影响。在75℃条件下进行15s的巴氏杀菌处理，能够有效杀灭大部分病原菌，并保留相对较高的乳过氧化物酶活性。这表明在适宜的温度下，乳过氧化物酶能够在一定程度上抵抗热处理带来的不利影响，并保持自身生物活性。当热处理温度升至85℃时，乳过氧化物酶的活性损失明显加剧，尤其是在处理时间延长的情况下，酶活性几乎完全丧失，说明过高的温度会破坏乳过氧化物酶的结构，导致其功能丧失。当热处理温度达到125℃时，无论处理时间如何，乳过氧化物酶的活性均几乎消失，这一极端条件的实验结果验证了高温对酶活性的破坏作用，也强调了应在实际生产中避免用过高温度处理牛乳。

其次，不同的灭菌方式会对乳过氧化物酶活性产生影响。例如，相较于传统的直接加热灭菌方式，低温陶瓷膜过滤处理在保留乳过氧化物酶活性方面展现出明显优势，能在不引入高温的前提下，有效去除牛乳中的微生物，并最大限度地保留乳过氧化物酶等热敏性生物活性物质。这一发现为乳制品加工工业提供了新思路，即通过非热处理手段实现牛乳的灭菌和保鲜。

最后，本文还探讨了贮藏温度、时间对乳过氧化物酶活性所产生的影响。实验结果表明，在同样的储存时间内，储存温度越高，乳过氧化物酶失去活性的速度越快，这可能是由于高温加速了酶分子的降解和失活。另外，随着储存时间的延长，不论储存温度如何变化，乳过氧化物酶活性都呈现出逐渐降低的趋势，这提示在乳制品贮藏和运输过程中，应严格控制贮藏条件，以减缓乳过氧化物酶活性的损失，进而延长产品的保质期。

最终我们可以得出三大结论：第一，热处理的温度对乳过氧化物酶的活性影响很大，温度过高会使酶活性迅速遭到破坏；第二，低温陶瓷膜过滤处理这种非热处理灭菌方法可以保留乳过氧化物酶的最大活性；第三，贮藏温度和时间对乳过氧化物酶的活性影响显著，为了延长产品的保质期，应严格控制贮藏条件。这为我们理解乳过氧化物酶的热处理过程提供了宝贵的参考，并为乳制品加工工艺的优化提供了科学依据，有助于通过优化生产工艺提高产品质量和安全性。

作者简介：张莹璐（1991-），女，汉族，山西大同人，实验师，硕士研究生，研究方向为生物科学。