胶体金试纸快速检测肥料中禁限用杀虫剂的应用研究

当前最受关注的禁限用农药包括有机磷类、氨基甲酸酯类杀虫剂，毒死蜱和三唑磷是一种高效、广谱的有机磷杀虫剂，对人体神经系统有较大危害；克百威是广谱高毒的氨基甲酸脂类杀虫剂，其氧化应激作用可引起明显的细胞毒性。同时，氨基比林类的氟虫腈由于对环境不友好亦被禁用。肥料是食品上游产业链的重要一环，而禁限用杀虫剂由于“效果好、见效快、价格低”等特点，且与肥料施用途径相同，因此常作为隐性成分被经销商或农户混配至肥料中。农业农村部公布的农药监督抽查结果显示，在肥料中非法添加禁限用隐性成分的问题仍不容忽视。然而，使用传统的检验方法，难以在肥料产品投入周期的各应用场景中进行快速筛查和监管。因此，有必要从肥料生产加工、流通贸易、田间施用等环节，建立肥料中禁限用农药快速筛查方法，以保障食品安全。

国内外针对禁限用杀虫剂的主要检测方法包括高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法、拉曼光谱法、毛细管电泳法，不但样品前处理复杂、检测时间长，而且需要昂贵的仪器设备。胶体金免疫层析法具备简便快速、灵敏度高、特异性强、无需昂贵的仪器设备等优点，且已研发出便于使用的商品化试剂盒产品，裸眼即可判定检测结果，但目前此类试纸条仅被用于果蔬农残检测，在肥料中的应用鲜见报道。肥料的基质与果蔬不同，目前尚无与之适用的商品化的快速检测试纸条供应，因此本实验通过优化前处理方法，探究针对肥料中毒死蜱、克百威、三唑磷、氟虫腈的快速高效的试纸条检测方法。

对胶体金试纸条结果的量化依靠于金标读数仪，此类仪器通常只与同一品牌规格的试纸条产品捆绑使用，不同品牌间的规格制式互不兼容。而智能手机集成了多种传感器，理论上可进行多通道数据量化，利用手机拍图比色分析在其他研究中已有先例。因此，本实验尝试对胶体金免疫层析试纸条的条带图像进行量化分析。

本实验拓宽了商品化的胶体金免疫层试纸条的应用范围，借由手机拍图量化数据，建立并评价了肥料中禁限用杀虫剂的快速筛查方法，以期为管控肥料非法混配禁限用杀虫剂提供参考，从上游保障食品安全。

一、仪器与试剂

本实验采用的通用型家庭园艺肥购自史丹利农业集团股份有限公司，粉碎后装瓶封存待用。

1.实验试剂。毒死蜱、克百威、三唑磷和氟虫腈购自农业农村部环境保护科研监测所，以上标准物质浓度为1000μg/mL。EDTA-2NA、甲醇、乙腈、乙酸均为分析纯，购自国药集团化学试剂北京有限公司。克百威快速检测试剂盒购自北京六角体科技发展有限公司，毒死蜱、三唑磷、氟虫腈快速检测试剂盒购自深圳市安鑫宝科技发展有限公司。

2.主要仪器设备。涡旋仪震荡器QL-866，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；回旋式振荡仪，江苏省金坛市环宇科学仪器厂；氮吹仪MODEL 8125，美国Organomation公司；高速离心机TGL-15B型，上海安亭科学仪器厂；高效液相串联质谱仪API-4000，AB SCIEX。

二、实验与方法

1.胶体金免疫层析试纸条检测与结果判读。（1）裸眼判读。将150μL待测液滴入试纸条样品孔中，水平放置层析10-15min，显色稳定后裸眼检视判读结果。阴性结果：T、C线都显红色，待测样液中所测成分浓度低于试纸条检测限。弱阳性结果：T线显浅红色，待测样品液中所测成分略低于检测限浓度，但能够对包被抗原产生竞争。阳性结果：只显示C线条带，此时待测样液中所测成分浓度大于裸眼消线浓度。试纸条失效：T、C线都不显或C线不显。

（2）手机拍图量化T、C线判读。如果待测液中被测物浓度在阴性浓度至裸眼消线浓度（检测限浓度）之间，试纸条检测结果显示为弱阳性，此时被测物浓度与试纸条T、C条带上的胶体金数目即显色程度相关，当被测物浓度升高，T线显色变浅直至裸眼消线浓度而完全消失。所以，当试纸条显示弱阳性系列结果时，可在一定范围内量化试纸条T、C线显色，线性回归半定量被测物浓度。

应用试纸条检测呈稳定显色后，置于背景板上，固定拍摄光源和拍摄距离，手机拍图，图像经ImageJ软件转8-bit图，翻转图片模式，仔细框选同一面积下的C线和T线的胶体金显色条带。以光密度（IntDen）表证胶体金的数目，因胶体金数目越多显色越深，从而量化得到T/C比值与浓度呈负相关，以此表证被测物浓度，实现对弱阳性结果的半定量分析，并借此评价前处理方法。

2.试纸条性能评价。以试剂盒PBS缓冲液稀释被测物标品，配制系列标准溶液，取150μL滴入试纸条加样孔中，10-15min内观察显色结果，手机拍照记录，量化识别判读T线、C线显色，考察试纸条的检测限与检测范围。

3.样品前处理。（1）提取剂的选择。肥料粉碎过筛，取2g于10mL离心管中，分组添加相当于毒死蜱试纸条5倍、3倍、1倍检测限浓度（即裸眼消线浓度）的加标量，分别采用3mL的PBS缓冲液、甲醇、乙腈作为提取剂，用简易提取法处理，试纸条检测，裸眼检视比较在各加标量下各提取剂的提取效果。

（2）优化提取方法。基于筛选出的提取剂，为保障回收率与精密度，继续优化提取方法。取2g空白肥料基质，添加试纸条相应检测限浓度的被测物标准品，分别采用震荡、超声、涡旋提取优化提取步骤，评价基质效应。

（3）提取液的净化。将提取液置于10mL玻璃管中，在-18℃冰箱中冻存30min，待出现絮状结晶后，经0.22μm注射过滤器过滤，取滤液0.5mL氮吹干，再用2mL的PBS缓冲液复溶得到待测液。

4.高效液相串联质谱法检测。（1）色谱条件。与试纸条方法的净化步骤有所不同，净化液氮吹干，应取流动相定容至2mL，上机检测基质匹配外标定量。色谱条件为：色谱柱ACQUITYUPLC，C18，1.7μm；柱温40℃，样品室温度20℃；进样量1μL。

正离子模式下的流动相为：0.1%甲酸+乙酸铵（A2），甲醇（B2），流速300μL/min。梯度洗脱：0-3.5min，95%A2线性变化至5%A2；3.5-5.5min，维持5%A2；5.5-5.7min，线性变化至95%A2；5.7-8min，维持95%A2。

负离子模式下的流动相为：纯水（A1），甲醇（B2），流速300μL/min。梯度洗脱：0-3min，55%A1线性变化至5%A1；3-4.7min，维持5%A1；4.7-6min，5%A1线性变化至55%A1；6-8min维持55%A1。

（2）质谱条件。电喷雾离子源；正负离子模式切换；多反应模式检测。各被测物的定性定量离子对、去簇电压、碰撞能量如表1所示。

5.添加回收实验验证一致性。按已优化的前处理步骤进行回收实验，试纸条检测每组平行测量3次，利用ImageJ软件进行光密度量化得到T/C比值，基质匹配标曲外标定量，验证试纸条检测方法。同时，应用液相串联质谱仪检测同批提取液，考察组内相关系数ICC，评价其与试纸条检测结果的一致性。

三、结果与分析

1.试纸条性能分析。用试剂盒PBS缓冲液稀释配制系列浓度溶剂标品，试纸条检测量化T、C线结果，以T/C值为纵坐标，浓度为横坐标，SPSS线性拟合，试纸条检测毒死蜱、克百威、三唑磷、氟虫腈的检测范围换算后分别为0.198-0.018μg/g、1.62-0.108μg/g、1.5-0.00936μg/g、0.084-0.0052μg/g。溶剂标曲分别为Y=1.063-8.422X，R2=0.879；Y=0.874-0.881X，R2=0.798；Y=0.952-0.678X，R2=0.778；Y=1.196-24.24X，R2=0.642。试纸条检测限即裸眼消线浓度换算后分别为0.198μg/g、1.62μg/g、1.5μg/g、0.084μg/g。不同种类试纸条的线性关系拟合度有一定差距，可能来源于各批次试纸条工艺，或是各种类抗原抗体间免疫反应性的灵敏度不同所致。

2.样品前处理。（1）提取剂的选择。应用简易提取方法，考察不同提取剂的效果。取2g肥料于10mL离心管中，添加相应浓度的毒死蜱标品，混匀后静置15min；取3mL提取剂，震荡提取5min，5000r/min离心5min；取0.5mL上清提取液，氮吹干后，用2mL的PBS缓冲液复溶，进行试纸条检测，结果如表2所示。甲醇的提取效果与乙腈相当，都在5倍、3倍检测限浓度的加标量下显示阳性与弱阳性结果，但甲醇作提取剂时，T、C条带整体显色较同浓度溶剂标品显色略浅，可能是甲醇中裹挟的无机盐过多，干扰免疫反应，或是胶体金状态不稳定干扰显色。而PBS缓冲液作提取剂时，可以省去吹干复溶步骤，但试纸条会失效，故选用乙腈作为提取剂，继续优化提取方法。

（2）优化提取方法。添加相应试纸条检测限的加标量至2g空白基质中，用3mL乙腈做提取剂，震荡提取、超声提取5min，离心后取0.5mL上清液氮吹干，再用PBS缓冲液2mL复溶，试纸条检测结果都为阴性。因为在震荡提取和超声提取过程中，复合肥料会在离心管内呈糊状结块而沉降导致提取不充分，所以在提取前加入水相，并采用涡旋提取以防止基质沉降。

优化后的步骤如下：①取2g肥料于10mL离心管内，加入2mL浓度为1mol/L的EDTA-2NA水溶液，轻摇润湿基质，水相分散基质改善了流动性，防止基质在提取过程中呈糊状结块，同时EDTA螯合金属离子增加了无机盐离子在水相中的分配，从而减少基质干扰。②加入1.5mL乙腈，涡旋提取5min，5000r/min离心5min，乙腈与水相在强电解质环境中自发盐析分层。③取上清液1.5mL于10mL玻璃管中，用乙腈重提一次（提取毒死蜱、克百威时，提取剂为1%乙酸酸化乙腈）。④合并上清提取液进行净化处理，降低无机盐残余量，得到待测液，用试纸条进行检测。

照上述前处理步骤制取空白基质提取液，稀释标准储备液，配制成系列浓度基质匹配标准溶液，经优化提取处理后用试纸条检测拍图量化，做基质匹配标准曲线，结果线性拟合如图1所示。

由图1可知，毒死蜱的基质匹配标曲为Y=0.9999-9.931X，R2=0.889；克百威的基质匹配标曲为Y=0.918-0.869X，R2=0.801；三唑磷的基质匹配标曲为Y=0.806-0.721X，R2=0.779；氟虫腈的基质匹配标曲为Y=1.142-22.226X，R2=0.693。与各自溶剂标曲斜率的差异较小，表明此前处理中的基质效应可接受，能够满足禁限用杀虫剂的快速筛查。

3.添加回收实验。在空白基质中分别添加试纸条检测呈弱阳性的两组加标量，基于已优化的前处理进行回收实验。平行测量三次，基质匹配标曲外标定量，试纸条检测毒死蜱、克百威、三唑磷、氟虫腈的回收率为67.22%-125.28%，相对标准偏差为3.61%-18.84%，详见表3。将相同提取液经液相色谱串联质谱检测，回收率为72.80%-123.86%。对两种方法的回收率做数据一致性分析，其组内相关系数ICC=0.634（＞0.4），表明两种方法所测结果有一致性，该试纸条检测方法可满足肥料中毒死蜱、克百威、三唑磷、氟虫腈的初筛应用。

四、讨论与结论

胶体金免疫层析试纸条检测迅速、查验方便、抗原抗体制备技术成熟、成本低、易普及且应用历史悠久，在半定量快速筛查中占据重要地位。结合手机拍图ImageJ量化T、C线显色，可以建立被测物浓度与试纸条显色的线性关系，但受手机自带拍摄软件算法“优化调整”的影响，易受外源影响而导致同一张试纸的多张图片经过ImageJ量化所得参数有所偏差，建立线性关系时的数据缺乏可比性，故可采取一定措施降低偏差。

将试纸条置于固定的光源、背景板和拍摄距离下采集图片，并于背景板上添加多张灰度值不一、形状方正的色卡作为一致性参照物。试纸条检测后，在有效观测时间内对同一试纸条多次采集，从复数结果中筛出背景板上一致性参照物，经ImageJ量化将参数近似的不同试纸图片作一个系列，则可认为此系列图片的采集条件一致，具有可比性。

本实验建立了利用胶体金免疫层析试纸条检测复合肥料样品中毒死蜱、克百威、三唑磷、氟虫腈的快速检测方法，其检测结果与高效液相串联质谱方法的检测结果具有一致性。该法检测毒死蜱、克百威、三唑磷、氟虫腈的检测限即裸眼消线浓度经换算分别为0.198μg/g、1.62μg/g、1.5μg/g、0.084μg/g，远高于肥料中隐性成分的有效添加量，能满足分析需求且方法可靠，为监管部门检测肥料中混配此四种禁限用杀虫剂的初步筛查提供了参考。