食品中菌落总数和大肠菌群的测定分析

近年来，食品安全问题频发，其中因微生物超标所致的食品质量问题占有较高的比重，因此加强食品卫生质量检验尤为重要。菌落总数、大肠菌群能够反映食品被微生物污染的程度，前者是在特定条件下每克检验样品中形成的微生物菌落总数，后者属于革兰阴性无芽孢杆菌，在人类、动物肠道中广泛分布，可产酸、产气，两者被公认为医药、食品等安全性指示菌。目前，关于食品中菌落总数和大肠菌群的测定方法有很多，常用的如纸片法、国标法等，不同方法的检测流程不同，结果也可能存在一定的差异性。因此，采用科学、有效的方法检测菌落总数和大肠菌群，可以为食品安全检测提供重要依据，从而更好地督促食品企业进一步保障食品安全。

一、材料与仪器

1.样品来源。检测样品包括肉制品、蜜饯、面包蛋糕、酱油、包装饮用水，均来源于XX食品有限公司；质控样均由北京中物信化化工技术研究院提供。

2.仪器与试剂。平板计数琼脂（PCA）培养基、结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA），青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；博迅BPX-162电热恒温培养箱，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；CLJ-E301激光尘埃粒子计数器，苏州市生源净化设备有限公司；生物显微镜CX43LF，奥林巴斯贸易（上海）有限公司；电子天平JEA2002，上海浦春计量仪器有限公司；XK97-A菌落计数器，常州金坛友联仪器研究院；LS-150LD立式压力蒸汽灭菌器，江阴滨江医疗设备有限公司；菌落测试纸片，广东环凯微生物科技有限公司。

二、实验与方法

1.国标法。（1）大肠菌群测定。①样品稀释。对于固体、半固体食品，取样25g保存于含有225mL生理盐水的无菌均质袋中，按照8000r/min的速率均质处理2min左右，形成1：10的样品匀液。对于液体食品，采用无菌吸管吸取25mL样品，保存于含有225mL生理盐水的无菌玻璃瓶中，采用机械振荡器予以振摇处理，制作为1：10的样品匀液。注意保证样品菌液pH值为6.5-7.5，若pH未达到适宜范围，可采用NaOH、HCL进行相应的调节。采用1mL移液器吸取样品匀液（以1mL为宜），顺管壁注入含有生理盐水的无菌试管中，振摇试管，使样品混合均匀，制备为1：100的样品匀液。

②平板计数。选择2-3个连续稀释度并接种于无菌皿，每皿1mL，再在无菌皿中加入1mL生理盐水作为空白对照。对15-20mL的VRBA进行熔化、恒温处理，温度以46℃为宜，然后倾注于平皿，经过旋转，使得培养基与样液混合均匀。琼脂凝固后，选择3-4mL的VRBA将平板表层覆盖，翻转后，保存于36℃左右环境下，培养18-24h。

③平板菌落数的选择。选择菌落数范围为15-150CFU的平板，对平板上可疑大肠菌群以及典型的菌落予以观察。典型菌落从外观上看为紫红色，周围可见胆盐与酸所形成的沉淀环，直径为0.5mm及以上。

④证实试验。在VRBA平板上选择典型及可疑菌落，如果菌落数量＜10个，就需要挑出所有典型及可疑菌落，再在煌绿乳糖胆盐肉汤管内接种，温度设置为36℃左右，培养24-48h，观察产气情况。如果产气，则提示大肠菌群阳性。

（2）菌落总数测定。①培养。样品稀释操作同上，在培养阶段等琼脂凝固后，翻转平板，温度调整为36℃左右，培养48h左右。水产品培养温度调整为30℃左右，培养时间为72h左右。如果发现样品中存在琼脂培养基弥漫生长菌落，需等凝固后，将琼脂培养基（4mL）覆盖于琼脂表面，经过凝固处理再将平板翻转，然后进行培养。

②菌落计数。先肉眼观察，或应用菌落计数器对稀释倍数进行观察记录，并记录对应的菌落数量，菌落数范围应选择30-300CFU。如果平板上无蔓延菌落，采用两个平板的平均数表示各个稀释度的菌落数。如果平板上菌落较大，一般不可采用，稀释度的菌落数宜采取无片状菌落的平板。如果片状菌落低于平板的50%，另一半呈均匀分布，需要对半个平板计算后×2作为平板菌落数。菌落总数计算公式为N=，其中N表示样品中菌落数，表示平板菌落数之和，n1、n2分别表示第1、第2稀释度的平板个数，d表示稀释因子。

2.纸片法。（1）菌落总数测定。样品处理同上，在接种环节，针对每个样品选择2-3个稀释度检测，包装饮用水可直接检测原液。在无菌环境下，采用1mL灭菌吸管吸取1mL测试菌稀释液，加入2个测试纸片，放下上盖膜，放置5min凝固后，轻压，放回自封袋，保持透明面向上，在36℃左右环境下培养15-24h。纸片上有红色斑点提示细菌生长，在计数时需要×稀释倍数，以获得样品的菌落总数。

（2）大肠菌群测定。采用无菌生理盐水将大肠菌群检测纸片浸润，贴于被检样品，保存于无菌塑料袋，完成采样后，将纸片保存于37℃培养箱，培养24h并观察。纸片转黄、可见红色斑点表示阳性，紫蓝色或未变黄则表示阴性。

3.统计学方法。计数资料、计量资料表示方法分别为（%）（±s），前者用卡方检验，后者用t检验，数据的组间比较均在SPSS22.0软件上处理，根据P值范围判断有无统计学差异，P＜0.05即差异显著。

三、结果与分析

1.菌落总数检测结果分析。两种方法对不同样品类型菌落总数的检出结果差异无统计学意义（P＞0.05），详见表1。

2.不同菌落数区间检测结果分析。对不同样品类型检测结果中菌落数区间进行分析，差异均无统计学意义（P＞0.05），详见表2。

3.不同方法对大肠菌群的检测结果分析。检测结果显示，国标法对不同样品大肠菌群的检测结果差异不大，详见表3。

四、结论与讨论

作为食品质量管理的重要组成部分，食品微生物检验主要用于食品中菌落总数及大肠菌群、酵母菌等各类菌群繁殖情况的检测，能够为食品安全生产及卫生评估提供可靠依据。菌落总数是微生物检验的重要指标，有助于了解食品受到污染的程度；大肠菌群则是一组与粪便污染相关的细菌，能够判断食品是否存在粪便污染。另外，菌落总数与大肠菌群存在本质上的区别，前者涵盖了有益菌与致病菌，菌落总数超标提示致病菌超标可能性更大，但不能直接得出致病菌超标的结论。

本研究将国标法与纸片法对照，检测结果差异不明显，表明两种方法均具有较高的应用价值，可应用于食品微生物检验。纸片法操作步骤简单，无需培养基配置，无需高压灭菌，能够减少人力、物力的投入，但对较大菌量的计数存在困难，且目前仅研制出少数几种类型的测试片，存在一定的局限性。应用国标法进行食品菌落总数、大肠菌群测定，准确性高，能够较好地检出污染严重的样品。国标法用时长、操作相对复杂，其他方法虽然能够简化步骤、缩短流程，但所需成本较高，仅能满足特定食品检验需求，因此，国标法仍是目前应用最为广泛的方法，应加强新技术研发，进一步优化试验方法，以保障检测的精准性、经济性。

需要注意的是，在各个检验环节应做好质量把控，坚持无菌操作的原则，精准执行每个步骤，以保障检测结果的准确性。每次检验时打开两块计数琼脂平板，在环境中的暴露时间应在15min以上，同时对平板及本批次样品进行培养。

作者简介：张慧（1988-），女，甘肃庆阳人，助理工程师，大学本科，研究方向为食品检测。