蒸发光散射法测定特殊医学用途婴儿氨基酸配方食品中氨基酸含量

本实验采用高效液相色谱-蒸发光散射法检测特殊医学用途婴儿配方食品中的多种氨基酸，可直接对未衍生的多种氨基酸进行基本的分离和含量的检测，结果准确可靠、灵敏度较高，且操作简便，可以避免衍生化操作，对测定特殊医学用途婴儿氨基酸配方食品中多种氨基酸具有参考价值。

一、仪器与试剂

1.仪器。液相色谱仪LC-20AD款，日本岛津仪器公司；蒸发光散射检测器3300，奥泰企业；纯水仪，Merck Millipore集团；电子天平JA3003，舜宇恒平公司。

2.试剂。丙氨酸（Ala）、亮氨酸（Leu）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Gln）、组氨酸（His）、苏氨酸（Thr）、脯氨酸（Pro）、酪氨酸（Tyr）、精氨酸（Arg）、缬氨酸（Val）、赖氨酸（Lys）、异亮氨酸（Ile）、苯丙氨酸（Phe）、羟脯氨酸（Hyp）、色氨酸（Trp）、半胱氨酸（Cys）、丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、蛋氨酸（Met），以上氨基酸标准样品的纯度均大于99%，安谱技术公司；三氟乙酸、全氟戊酸和七氟丁酸，麦克林公司，色谱纯；甲醇，TEDIA公司，色谱纯。

二、实验与方法

1.色谱条件。色谱柱：Venusil AA（4.6×250mm，5μm）；柱温：29℃；进样量：10μL；流速：0.5-1.0mL/min；蒸发光散射器漂移管温度：90℃；氮气流速：1.5L/min；流动相A相为水、三氟乙酸、七氟丁酸和全氟戊酸，B相为甲醇。梯度洗脱程序如表1所示。

2.供试品溶液的制备。称取一定质量的特殊医学用途婴儿氨基酸配方食品于离心管中，加入适量蒸馏水，超声20min，取出后以6000r/min离心5min，移取其中清液转移到50mL容量瓶中，加水稀释到刻度，经过滤后供分析。

3.对照品溶液的制备。分别于10mL容量瓶中称取19种氨基酸对照品10mg，用水定容至10mL即得19种氨基酸贮备液（1000.0mg/L），于2℃-8℃条件下保存。准确移取一定量的羟脯氨酸贮备液，用水稀释定容，配制成浓度分别为10.00、100.0、400.0、600.0、800.0、1000mg/L的一系列工作液，用于高效液相色谱分析。

4.氨基酸定量分析。液相色谱仪分别吸入不同工作液，测得峰面积。以峰面积的对数作为纵轴、溶液浓度的对数为横轴，制定标准曲线。将供试品溶液注入液相色谱仪中，得到峰面积，并根据所述标准曲线，得到待测样品中氨基酸的质量浓度。各氨基酸的含量可以通过以下公式计算：

在上式中，X为试样的待测组分的含量（mg/kg），A为待测物的质量浓度（mg/L），V为供试品的定容体积（mL），m为试样质量（g）。

如果氨基酸含量超过线性范围，则应适当稀释后重新测定。

三、结果与讨论

1.色谱条件的优化。（1）流动相种类的选择。对于流动相A，实验首先选用水、三氟乙酸、七氟丁酸和全氟戊酸作为流动相A进行梯度洗脱，结果发现甘氨酸与丝氨酸分离效果不佳，后来在原有流动相基础上加入了少量全氟戊酸，二者的分离状况有所好转。对于流动相B，实验中尝试以甲醇和乙腈两者作为流动相B，结果发现具有过强洗脱能力的乙腈会造成脯氨酸及之后的多种氨基酸保留时间明显提前，导致这些氨基酸分离效果不佳，尽管甲醇作为有机相会使整体出峰时间延后，但分离效果更好，所以选择甲醇。

（2）流速和柱温的选择。尽管通过流动相的选择使得大多氨基酸的分离效果达到较好的效果，但谷氨酸和苏氨酸在1.0mL/min流速和40℃下仍不能较好分离，故分别降低流速和柱温进行测试，最终发现在0.5mL/min流速和29℃条件下，两者可以达到较好的分离效果。不过，较慢的流速使得大多数本就分离效果良好的氨基酸保留时间过于滞后，因此综合考虑，柱温选择29℃（22-22.50min），流速上升至1.0mL/min。

（3）蒸发光散射检测器参数的选择。本实验分别设定了漂移管温度为50℃、70℃、90℃和110℃条件下，对色谱图的信噪比进行测试，结果表明在90℃条件下噪声较小，因此漂移管温度最终设定为90℃。另外在90℃条件下，对0.5、1.0、1.5、2.0L/min的氮气流速进行测试，结果发现虽然在低氮气流速条件下，目标峰响应较高，但是多种氨基酸分离情况不佳，相应的高氮气流速条件下，响应却不理想。因此，最终确定1.5L/min为氮气流速。

2.对照品溶液氨基酸的分离。按上述色谱条件，将对照品溶液上机测试，得到19种氨基酸色谱图（图1）。说明在上述色谱条件下，氨基酸能完成较好的分离。

图1：对照品溶液色谱图

注：1.Gly；2.Ser；3.Asp；4.Hyp；5.Gln；6.Thr；7.Ala；8.Cys；9.Pro；10.Val；11.Met；12.Tyr；13.Lys；14.His；15.Arg；16.Ile；17.Leu；18.Phe；19.Trp

3.线性范围、检出限。按上述色谱条件，分别对19种氨基酸对照品的标准工作液进行分析测试。以各氨基酸峰面积的对数作为纵轴，以氨基酸浓度（mg/L）的对数作为横轴，作标线，得到各氨基酸的线性回归方程，在0.01-1.0mg/mL氨基酸浓度范围之内，具有良好的线性关系；以信噪比≥3作为检出限，得出各氨基酸的检出限范围为20-55mg/kg。

4.回收率和精密度。采取同类基质某特殊医学用途婴儿配方食品空白样品进行回收率和精密度试验，分别添加20、40、100mg/kg三水平的标准物质，分别测定6次，得到各氨基酸的精密度及回收率，结果见表2。最终结果表示，回收率为90.2%-104.5%，相对标准偏差为1.5%-3.2%。

5.供试品分析。对特医用途婴儿配方食品进行分析测试，可测得各氨基酸的含量结果如下（结果均以g/100g计）：Gly，0.920；Ser，0.905；Asp，1.201；Gln，1.450；Thr，0.882；Ala，0.674；Pro，1.402；Val，1.186；Met，0.277；Tyr，0.735；Lys，1.115；His，0.703；Arg，1.349；Ile，1.008；Leu，1.879；Phe，0.850；Trp，0.365；Hyp和Cys未检出。详见图2。

基金项目：浙江省市场监管局科技计划项目（ZC2023043）。

作者简介：黄润韬（1995-），男，大学本科，助理工程师，研究方向为食品质量安全检测。

*通信作者：朱帅（1991-），男，大学本科，工程师，研究方向为食品质量安全检测。