两种测定肉制品中牛、猪源性成分的方法对比研究

随着经济的发展，人们对肉类的需求量日益增长，一些无良商家为了牟取暴利，掺假现象层出不穷，对人的身体健康造成危害。目前，在生物学领域鉴定动物源性成分的方法以核酸分析为主，检测方法有实时荧光PCR、普通PCR、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性、PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）等。其中，实时荧光PCR技术凭借简便、高效等特点，广泛应用于肉制品的检测中，具有广阔的发展前景。该技术通过物种特异性引物探针进行扩增，实时监控整个检测过程。试剂盒法利用PCR具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点，加上自带内参检测条件的优势，更能有效避免假阴性率，是今后检测的一个重要方向。本次检测按照GB/T 38164-2019和SN/T 2051-2008的要求对肉制品中牛、猪源性成分进行了分析，对比了两种检测方法的检出限、灵敏度、特异性等，分析了不同检测方法之间的差异性，及在实际应用中的优势。

一、材料与方法

1.样品采集。样品采集于大型商场、农贸市场、电商平台，随机购买预包装牛肉丸、生鲜牛肉各10份。预包装牛肉丸成分表均显示有牛肉成分，无标注猪肉成分，日期在有效期内并包装完好。生鲜牛肉均为未分切部分，一个样品分装在一个袋子中，做好编号，冷藏运送于实验室。

2.主要试剂和仪器设备。各阳性标准物质（均由正规公司购入），TaKaRa DNA提取试剂盒，牛、猪源性成分实时荧光PCR检测试剂盒，猪、牛、内参基因的引物探针（均由生工生物工程（上海）股份有限公司购买合成），PCR Master Mix（2X），实时荧光定量PCR仪，高速台式冷冻离心机（最高转速12000r/min以上），小型台式恒温摇床，微量可调移液器及配套吸头（10uL、100uL、1000uL），离心管等。

3.方法。（1）前处理。生鲜牛肉：经70%乙醇和蒸馏水冲洗3遍，捣碎，收集到干净50mL离心管中，依次做好编号，并于-20℃以下保存。牛肉丸：捣碎，收集到干净50mL离心管中，依次做好编号，并于-20℃以下保存。

（2）DNA提取。两个标准明确，均可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA，本实验采用的是TakaRa品牌，验收结果满意。具体流程按照说明书规范操作，收集的模板DNA溶液于-4℃保存。

（3）扩增试剂准备。国标法：将用到的试剂回温并颠倒混匀，2000r/min离心10s，引物探针需由储备液配制成工作液，设所需的PCR反应管为n（n=1阳性对照+1阴性对照+1空白对照+样本数），按表1计算好各试剂所需量，加入离心管中，完全混匀并在2000r/min条件下离心10s，分别向设定的各反应管中加入22.5uL。每个项目的配制操作均一致，需另外配制内参的体系。

行标法：将试剂盒回温并混匀离心，试剂盒中已包含表1中的试剂均可直接使用，如国标法所示设置好相应数量的反应管数，分别加入24uL反应体系，混匀待用。无需配制内参体系，本试剂盒自带内参。

（4）加样。向体系中加入DNA模板，以含目标成分的标准物质为阳性对照，用水作为阴性、空白对照，样品反应管加入样品DNA提取待测液。加入量见表1。

（5）实时荧光PCR扩增。分别进行靶向基因和内参基因扩增，以Ct值平均值作为最终结果。国标法的反应参数为：95℃、10min，95℃、15s，60℃、1min，40个循环；行标法的参数为：95℃、10s，95℃、5s，60℃、20s，40个循环。

（6）反应参数优化。由于国标法的扩增时间过长，通过反复对反应参数进行调整测试，设置测量动物源性成分的最佳条件如下所示：95℃、10s，95℃、5s，60℃、34s，40个循环，该条件下对实验结果无影响。本实验的结果均使用优化后的反应参数进行扩增。

（7）结果的判断。国标法：在内参、空白及阴、阳性对照成立的情况下，Ct值≤35.0表示被检样品是阳性；Ct值≥40.0表示被检样品为阴性；若35<Ct值<40.0，则重复一次，如Ct值<40.0为阳性，Ct值≥40.0为阴性。行标法：在HEX通道结果满足的情况下，被测样品有FAM荧光检出且Ct值<35.0，表示被检样品为阳性，无FAM荧光检出且Ct值>35.0，表示被检样品为阴性。

二、结果与分析

1.检出率。根据检测标准，分别对10份牛肉丸和生鲜牛肉进行牛、猪源性成分的检测，通过PCR技术扩增，以Ct值的平均值为最终结果。用两个标准检测的生鲜牛肉、牛肉丸的牛源性成分检出率均为100%，生鲜牛肉的猪源性成分检出率0%，牛肉丸的猪源性成分检测结果见表2。其中，国标法检出5份有猪源性成分，行标法检出7份有猪源性成分，表明产品存在与成分表不符的现象。Ct值越大，说明猪源性成分越多，通过对比样品8、9可知，浓度较低的样品，利用国标法可能存在假阴性结果，造成漏检的现象，行标法的检出率更高。

2.最低检出限。选取3份未检出猪源性成分的生鲜牛肉，各称取25mg，分别加入100%、10%、1%、0.1%、0.01%浓度的猪阳性标准溶液，利用商品化试剂盒进行DNA提取，过程中防止交叉污染，以样品空白、试剂空白作为质控手段。体系配制和DNA扩增根据相应标准进行，通过实时荧光PCR仪进行扩增，以各浓度Ct值的平均值作为最终结果。

当阳性标物浓度为100%、10%、1%，两个标准均可检出猪源性成分，行标法的Ct值更加稳定。浓度为0.1%时，国标法的Ct值>40.0，未检出猪源性成分，而行标法在0.1%时，Ct值仍<35.0，且数据稳定，0.01%时未检出猪源性成分。国标法的最低检出限可达到1%，行标法为0.1%。

3.特异性。对10份生鲜牛肉进行猪源性成分的检测，均未检出猪源性成分，说明这10份原材料不存在掺假猪肉的现象。在此前提下，利用牛的特异性引物探针配制体系，分别加入已稀释过不同浓度的牛、猪标准物质DNA溶液进行干扰，采取增加提取空白、扩增空白等手段来验证其准确度，用两种方法对其进行DNA扩增，结果均检出牛源性成分，未检出猪源性成分。这说明两种方法的特异性均较好，是排除假阳性的有效手段之一。

三、讨论

通过方法差异性、检出率、最低检出限、特异性对现行的两个标准进行试验比对，目的是找到更适用鉴定牛肉、牛肉丸这类肉制品是否掺假的方法，提高数据的准确性，从而为打击掺假行为提供有效的技术支持。

在方法差异性方面，国标法在体系配制环节较为传统，需要根据标准合成相应的碱基序列的引物探针，使用前需配置成工作液，容易导致浓度过高或过低，储备液的反复冻融加大了污染的概率并且容易失活，导致试剂的灵敏度降低。行标法具有简便、快速、耗时短、抗污染性强等特点，试剂盒自带内参照、水、阳性DNA等，只需按比例配成体系即可，减少了实验人员因操作不当带来的污染，同时自带的内参照也可以有效避免假阴性的结果，弥补了国标法的不足，但是价格稍高。

反应参数的选择和设置，是扩增的关键点之一，在不影响检测数据的前提下可以对国标法进行优化，此优化主要参考试剂盒法的反应参数。优化后的参数设置，不仅可以缩短扩增时间，不同的项目也可以一起扩增，很大程度上缩短了检测时间，提高了检测效率。

在检出率方面，两个标准略有差异。当出现外源基因Ct值在临界值时，应考虑是否因实验员操作不当、耗材间出现交叉污染、样品在生产流通环节存在污染等因素，通过增加质控手段对整个实验进行监控，排除可能造成结果差异性的外在因素。行标法检出阳性率比国标法高，取决于二者的最低检出限，行标法较低的检出限是筛查外源基因含量低的好方法，以防漏检，客观反映数据的真实性。

基于二者的试验比对结果，两个标准均可检测出肉制品中的掺假成分，具备较强的特异性、良好的灵敏度、较高的准确度。行标法比国标法略有优势，但价格较昂贵。相比之下，行标法检出限较低，可以有效排除漏检现象，试剂盒快速、简便、准确的特点也可应对繁重的检测任务。因此，在考虑时间成本和效率的情况下，建议使用行标法对该类产品进行检测，必要时也可两个标准配合使用，提供真实、有效的数据，更好地保障消费者权益。

作者简介：龚晓咏（1996-），女，汉族，广东广州人，助理工程师，大学本科，研究方向为食品营养。

高嘉明（1991-），女，汉族，广东广州人，工程师，大学本科，研究方向为食品营养。

张琴（1986-），女，汉族，海南人，工程师，大学本科，研究方向为食品营养。