固相萃取-气相色谱法测定焦糖色素中4-甲基咪唑

摘 要：目的：建立固相萃取-气相色谱法测定焦糖色素中4-甲基咪唑的方法。方法：样品经Chem Elut硅藻土柱净化富集、二氯甲烷洗脱浓缩，采用DB-1701气相色谱柱，氢火焰离子化检测器测定。结果：4-甲基咪唑在100～500 μg·mL-1具有良好的线性关系，检出限为0.002 mg·mL-1，平均加标回收率在100.2%～100.7%，相对标准偏差为0.2%～0.5%。结论：该方法重现性好，操作简单快速，定量准确，能够满足分析检测的需求，适合在焦糖色素质量控制中使用。

关键词：4-甲基咪唑；固相萃取；气相色谱法；焦糖色素

Determination of 4-Methylimidazole in Caramel Pigment by Solid Phase Extraction and Gas Chromatography

CAI Huimin1， CAO Xinjie2*

（1.China Quality Certification Centre， Beijing 100070， China;

2.Beijing Pinggu District Market Supervision and Administration Inspection and Testing Center， Beijing 101200， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of 4-methylimidazole in caramel pigments by solid phase extraction and gas chromatography. Method： The samples were purified and concentrated by Chem Elut diatomite column， eluted and concentrated by dichloromethane， and determined by DB-1701 gas chromatographic column and hydrogen flame ionization detector. Result： 4-methylimidazole had a good linear relationship in the range of 100～500 μg·mL-1， the detection limit was 0.002 mg·mL-1， the average recovery rate was 100.2%～100.7%， and the relative standard deviation was 0.2%～0.5%. Conclusion： The method has good reproducibility， simple and rapid operation， accurate quantification， can meet the needs of analysis and detection， and is suitable for use in caramel color quality control.

Keywords： 4-methylimidazole; solid phase extraction; gas chromatography; caramel pigment

焦糖色素是一种在食品中应用范围十分广泛的着色剂[1-3]。焦糖色素可以分为天然和人工合成两大类[4-6]。4-甲基咪唑是以亚硫酸铵为原料生产人工合成焦糖色素的副产物，为含氮杂环咪唑类化合物[7]。大剂量使用4-甲基咪唑，会导致动物致癌[8]。《食品安全国家标准 食品添加剂 焦糖色》（GB 1886.64—

2015）中规定，以氨法焦糖和亚硫酸铵法合成的焦糖色素中的4-甲基咪唑含量不得超过200 mg·kg-1[9]。而这两类焦糖色素普遍应用在酱油、醋、料酒、啤酒、碳酸饮料和茶类饮料中[10-11]。因此，准确快速地测定焦糖色素中的4-甲基咪唑具有十分重要的意义。

目前，国内外普遍使用液相色谱-串联质谱联用技术测定4-甲基咪唑[12]。本研究拟采用固相萃取-气相色谱法检测焦糖色素中的4-甲基咪唑，建立一种重现性好、简单、快速、准确地测定焦糖色素中4-甲基咪唑的方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

焦糖色素，市售。

二氯甲烷；三氯甲烷；丙酮；乙腈（色谱纯）；氢氧化钠（3 mol·L-1）；Chem Elut硅藻土柱；4-甲基咪唑标准品（Dr.E 99.06%）。

Agilent 7890气相色谱仪，美国安捷伦科技公司；电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；旋转蒸发仪，步琦实验室设备贸易（上海）有限公司；Milli-Q超纯水系统，美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 气相色谱分析条件

色谱柱为DB-1701毛细管柱（30 m×0.32 mm，

0.25 μm）。升温程序：初始温度为70 ℃，以

10 ℃·min-1升至170 ℃并保持3 min，再以

20 ℃·min-1升至280 ℃。进样口和检测器温度分别为250 ℃和280 ℃。使用氢气流量为40 mL·min-1，空气流量为350 mL·min-1，氮气作为载气，流速为

1.0 mL·min-1。采用分流进样，分流比为10∶1，进样体积为1 μL。

1.2.2 标准溶液配制

4-甲基咪唑标准储备液（1.0 mg·mL-1）：称取50.0 mg 4-甲基咪唑标准品溶于50 mL容量瓶中，用少量丙酮，冷藏保存，有效期为12个月。标准工作液：将4-甲基咪唑标准储备液用丙酮稀释至

100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、300 μg·mL-1、400 μg·mL-1和500 μg·mL-1。

1.2.3 样品前处理

称取5.00 g焦糖色素，加入2.5 mL氢氧化钠溶液混匀，转移至硅藻土柱。用二氯甲烷清洗烧杯并转移至柱中，静置10 min。收集50 mL洗脱液，浓缩至2 mL后移入5 mL容量瓶，用丙酮洗涤并定容至刻度，混匀备用。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的优化

本研究考察HP-INNOWAX、HP-5MS、DB-1701

3种色谱柱对4-甲基咪唑峰型的影响。结果表明，HP-INNOWAX和HP-5MS色谱柱的响应高但拖尾严重，峰形差。而DB  -1701色谱柱的基线平稳，响应值高，分离效果和峰型良好。

2.2 洗脱剂的选择

在空白样品中加入4-甲基咪唑（100 mg·kg-1），制备样品S1，并优化前处理方法。使用50 mL不同洗脱剂（二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮和乙腈）进行洗脱，以回收率评估效果。样品的回收率不宜过高，否则可能会导致基质效应增强。实验重复3次。由表1可知，二氯甲烷的洗脱效果最佳，回收率为101.1%，精密度较高。综合考虑，选择二氯甲烷作为最终洗脱溶剂。

2.3 洗脱剂用量的优化

研究考察不同洗脱剂用量（10 mL、20 mL、

50 mL、80 mL和100 mL）对4-甲基咪唑回收率的影响，实验重复3次。由表2可知，随着洗脱剂用量的增加，4-甲基咪唑的回收率呈现先升高后降低的趋势，这可能是由于杂质增多导致基质效应。综合考虑精密度、节约试剂和检测效率，本研究选择洗脱剂体积为50 mL。

2.4 标准曲线及方法检出限

对系列标准工作液进行上机测定，以4-甲基咪唑的浓度为横坐标，以4-甲基咪唑的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，4-甲基咪唑的线性回归方程为y=3.101 98×10-1x-1.292 98，R2=0.999 9。当信噪比为3时，4-甲基咪唑的检出限为0.002 mg·mL-1。

2.5 回收率及精密度

在空白样品中分别添加50 mg·kg-1、100 mg·kg-1和500 mg·kg-1的4-甲基咪唑，根据1.2.3的前处理方法和1.2.1的气相色谱分析条件进行检测，平行测定3次，计算4-甲基咪唑的回收率及精密度。回收率以及精密度结果见表3。

2.6 样品测定

取市售焦糖色素样品3份，分别根据1.2.3的前处理方法和1.2.1的气相色谱分析条件进行检测，平行测定3次，分别计算4-甲基咪唑的含量。由表4可知，3份市售焦糖色素样品都含有较高含量的4-甲基咪唑，但都不超过GB 1886.64—2015中规定的含量要求（200 mg·kg-1）。

3 结论

本文开发了一种使用Chem Elut硅藻土柱和二氯甲烷洗脱的前处理技术，结合气相色谱-氢火焰离子化检测器来检测焦糖色素中的4-甲基咪唑。结果显示，该方法具有良好的重现性、操作简便、快速且定量准确，能够满足分析检测要求，并适用于焦糖色素的质量控制。此技术可广泛应用于实验室和生产现场，为人工合成焦糖色素的质量控制提供有效的技术支持。

参考文献

[1]林晓珊，杭义萍，吴惠勤，等.气相色谱-串联质谱法测定焦糖色素中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑[J].分析试验室，2011，30（11）：85-88.

[2]SHIH Y H，LIRIO S，LI C K，et al.Determination of imidazole derivatives by micellar electrokinetic chromatography combined with solidphase microextraction using activated carbon-polymer monolith as adsorbent[J].J Chromatogr A，2016，1428：336-345.

[3]PETRUCI J F S，PEREIRA E A，CARDOSO A A.Determination of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole in caramel colors by capillary electrophoresis[J].J Agr Food Chem，2013，61（9）：2263-2267.

[4]孟颖.焦糖色素着色食品中甲基咪唑测定方法的研究及应用[D].太原：山西大学，2014.

[5]XU X B，LIU D B，YU S J，et al.Separation and determination of 4-methylimidazole， 2-methylimidazole and 5-hydroxymethylfurfural in beverages by amino trap column coupled with pulsed amperometric detection[J].Food Chem，2015，169：224-229.

[6]王淼，陈海珍.高效液相色谱法测定焦糖中4-甲基咪唑的含量[J].中国处方药，2015，13（10）：

25-26.

[7]吴翠华，郑学殷，李巧琪，等.QuEChERS结合高效液相色谱-串联质谱法测定酱油中的4-甲基咪唑[J].当代化工，2018，47（3）：653-656.

[8]MORITA T，UNEYAMA C.Genotoxicity assessment of 4-methylimidazole：regulatory perspectives[J].Genes Environ，2016，38（1）：20.

[9]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品添加剂 焦糖色：GB 1866.64—2015[S/OL].（2015-11-13）[2024-10-22].http：//down.foodmate.net/standard/yulan.php？itemid=48439.

[10]李美玲，王卓琳，黎庆涛，等.焦糖色素及其研究进展[J].中国调味品，2019，44（9）：183-187.

[11]庞美蓉，林钦，戴明，等.超高效液相色谱-串联质谱法同步检测食品中的2-甲基咪唑及4-甲基咪唑[J].分析测试学报，2016，35（8）：943-948.

[12]王爱军.气相色谱串联三重四极杆质谱测定焦糖色中4-甲基咪唑[J].食品工业，2019，40（7）：321-323.

作者简介：蔡慧敏（1991—），女，内蒙古鄂尔多斯人，硕士，工程师。研究方向：食品安全分析。

通信作者：曹新杰（1988—），女，北京人，硕士，工程师。研究方向：食品加工与安全。E-mail： 729858032@qq.com。