高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱法测定大米5种硒形态

摘 要：建立了一种采用高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱联用仪测定大米中硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基-硒代半胱氨酸（MeSeCys）、亚硒酸根[Se（Ⅳ）]、硒代蛋氨酸（SeMet）及硒酸根[Se（Ⅵ）]

5种硒形态的分析方法。利用小麦粉质控样（ERM-BC210a）中硒代蛋氨酸的测定回收率分析优化硒形态的提取效果；以O2作为反应池气体，在硒元素质量转移Se（m/z 80＞96）模式下，以Hamilton PRP-X100为分析柱，以5 mmol·L-1的柠檬酸溶液（pH=5.0）为流动相，采用高效液相色谱-电感耦合等离子体串联质谱联用法检测。结果表明，在0.5～200.0 μg·L-1，各硒形态线性关系良好，相关系数均大于0.999 5；SeCys2、MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet和Se（Ⅵ）检出限分别为0.002、0.004、0.005、0.002 mg·kg-1和0.001 mg·kg-1；在0.025、0.100、0.250 mg·kg-1 3个加标水平下，各硒形态的平均加标回收率为79.9%～106.3%。10批海南地区大米中主要检出的硒形态为SeMet，其他硒形态均未检出。该方法准确、灵敏，可满足大米中硒形态的

定量分析。

关键词：硒形态；大米；高效液相色谱-电感耦合等离子串联质谱联用仪

Determination of Five Selenium Species in Rice by High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Tandem Mass Spectrometry

FU Yufu， WEI Ying， LIU Dongni， KANG Rui， LIN Zhifan， GU Mantun*

（Institute of Food Testing， Hainan Academy of Inspection and Testing， Key Laboratory of Tropical Fruits and Vegetables Quality and Safety， State Administration for Market Regulation， Haikou 570314， China）

Abstract： A method was developed for the determination of five selenium forms in rice， including selenocystine （SeCys2）， methyl-selenocysteine （MeSeCys）， selenite [Se（Ⅳ）]， selenomethionine （SeMet） and selenate [Se（Ⅵ）]， by high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma tandem mass spectrometry. The recovery rate of selenomethionine in wheat flour quality control sample （ERM-BC210a） was used to analyze and optimize the extraction effect of selenium morphology. O2 was used as the reaction cell gas， selenium mass transfer Se （m/z 80＞

96） mode， Hamilton PRP-X100 was used as the analytical column， and 5 mmol·L-1 citric acid solution （pH=5.0） was used as mobile phase and was detected by high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma tandem mass spectrometry. The results showed that in 0.5 to 200.0 μg·L-1， the linear relationship between selenium morphology was good， and the correlation coefficients were greater than 0.999 5， and the detection limits of SeCys2， MeSeCys， Se（Ⅳ）， SeMet and Se（Ⅵ） were 0.002 mg·kg-1， 0.004 mg·kg-1， 0.005 mg·kg-1， 0.002 mg·kg-1 and

0.001 mg·kg-1， respectively. The average recoveries of selenium forms were from 79.9% to 106.3% at the three spike levels of 0.025 mg·kg-1， 0.100 mg·kg-1 and 0.250 mg·kg-1. SeMet was the main selenium form detected in 10 batches of rice from Hainan， while no other selenium forms were detected. This method is accurate and sensitive， which can meet the quantitative analysis of selenium form in rice.

Keywords： selenium species; rice; high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma tandem mass spectrometry

硒元素是人体必需的一种微量元素，其通过抗氧防御机制参与人体免疫系统防御，增强抗病毒能力、排毒与抗氧化功能等[1]。饮食摄取是人体补硒最主要的途径，但是我国是较严重的缺硒国家之一。据统计，我国有72%的地区缺硒，其中29%为严重缺硒地区[2]；2006年海南省地质调查院首次宣布在海南岛发现富硒土壤占全岛总面积的28.14%，主要分布在海南岛中东部地区[3]。海南硒资源位居全国前列，同时是粮食作物水稻的主要种植地区，但针对海南地区大米中的硒含量及硒形态的研究报道较少。

目前，测定大米中硒元素的方法较多，主要包括氢化物发生-原子荧光光谱法（Hydride Generation-Atomic Fluorescence Spectrometry，HG-AFS）、电感耦合等离子体质谱法（Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，ICP-MS）、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用仪法（High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，HPLC-ICP-MS）等。其中，HG-AFS法操作简便，但灵敏度较低；ICP-MS法灵敏度高[4]，但其采用氦气碰撞模式，由于氩原子离子、稀土双电荷等对丰度最高的80Se有干扰[5]，常选用丰度较低的78Se作为硒元素的检测质量数，信号响应较低。本研究采用的电感耦合等离子体串联质谱（Inductively Coupled Plasma Tandem Mass Spectrometry，ICP-MS/MS）技术具备两组四极杆质量过滤器，在O2反应模式下，硒元素检测质量数可由80Se+转换成80Se16O+，由此可消除多原子离子等干扰[6]，可使检测结果更准确、更灵敏；同时利用液相色谱技术与ICP-MS/MS相结合，在O2模式下，可使硒形态检测结果更加准确。

本研究建立同时测定海南大米中硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基-硒代半胱氨酸（MeSeCys）、亚硒酸根[Se（Ⅳ）]、硒代蛋氨酸（SeMet）及硒酸根[Se（Ⅵ）] 5种硒形态的高效液相色谱-电感耦合等离子串联质谱联用（High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma Tandem Mass Spectrometry，HPLC-ICP-MS/MS）分析方法，以获得更准确的检测结果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大米，产自海南海口、琼海、五指山等市县，共计10批次。

SeCys2溶液标准物质[GBW 10087，（44.2±

1.0）μg·g-1，以Se计]、MeSeCys溶液标准物质[GBW 10088，（34.8±1.0）μg·g-1，以Se计]、Se（Ⅳ）溶液标准物质[GBW 10032，（42.9±0.9）μg·g-1，

以Se计]、SeMet溶液标准物质[GBW 10034，（39.4±1.0）μg·g-1，以Se计]、Se（Ⅵ）溶液标准物质[GBW 10033，（41.5±1.3）μg·g-1，以Se计]，中国计量科学研究院；小麦粉质控样[批号ERM-BC210a，硒代蛋氨酸标示值（27.4±2.6）mg·kg-1]，英国LGC公司；胰蛋白酶γ（CAS：9002-07-7），国药集团；蛋白酶K（CAS：39450-01-6），麦克林；链蛋白酶E（CAS：9036-06-0），上海源叶生物；硝酸（优级纯），德国默克；三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐（TRIS-HCl，纯度99%），阿法埃莎化学；氨水（色谱纯），德国默克；Milli-Q超纯水，德国默克。

1.2 仪器与设备

1260型高效液相色谱仪，美国Agilent；8900型感耦合等离子体串联质谱仪，美国Agilent；阴离子交换色谱柱Hamilton PRP-X100（150 mm×

4.6 mm，5 μm）；Thermo IonPac AS19（250 mm×

4 mm）；Thermo IonPac AS7（250 mm×4 mm）；MARS型微波消解仪，美国培安；XS204型电子分析天平，瑞士梅特勒；SHZ-C型恒温振荡水浴，上海龙跃；SK7200B 超声波清洗器，上海科导；Multi reax（EX）涡旋混合器，德国海道夫；Million Q型超纯水器，德国默克。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

精密称取2 g大米粉于15 mL离心管中，加入链霉蛋白酶E 20 mg与样品混匀，加入10 mL

75 mmol·L-1 Tris-HCl提取液，涡旋振荡混匀

1 min，超声30 min后，于37 ℃恒温水浴振荡4 h，10 000 r·min-1离心3 min，上清液过0.22 μm水系滤膜，滤液为待测液。

小麦粉质控样ERM-BC210a根据证书含量计算，准确称取0.3 g样品于50 mL离心管中，后续操作同样品一致。

1.3.2 溶液配制

混合标准储备液：用电子分析天平分别称取一定量的MeSeCys、Se（Ⅳ）、SeMet、SeCys2和Se（Ⅵ）标准物质，用水稀释并定容，分别得到质量浓度为10 μg·mL-1的标准储备液。