高效液相色谱法测定荔枝酒中山梨酸含量的不确定度评定

摘 要：目的：评定高效液相色谱法测定荔枝酒中山梨酸含量的不确定度。方法：按照《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》（GB 5009.28—2016）进行检测，并依据测量不确定度的规程要求，构建数学模型和评估方法，分析不确定度来源并进行计算、合成。结果：荔枝酒中山梨酸含量为

0.178 6 g·kg-1，扩展不确定度为0.011 6 g·kg-1（置信概率P=95%，k=2）。结论：标准物质纯度以及标准工作曲线拟合是不确定度的主要来源，测定时应严格控制这些因素，以提升检测结果的准确性。

关键词：不确定度；山梨酸；高效液相色谱；荔枝酒

Evaluation of Uncertainty in the Determination of Sorbic Acid Content in Litchi Wine by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Yanshao， ZHOU Tingting， TANG Fengqiao， LI Xiaomei， LIN Cailan*

（Lingshan County Product Quality Inspection Center， Qinzhou 535499， China）

Abstract： Objective： To evaluate the uncertainty of determination of sorbic acid in litchi wine by high performance liquid chromatography. Method： According to the GB 5009.28—2016， a mathematical model and evaluation method were constructed according to the requirements of the procedure for measuring uncertainty， and the sources of uncertainty were analyzed， calculated and synthesized. Result： The content of sorbic acid in litchi wine was 0.178 6 g·kg-1， and the extended uncertainty was 0.011 6 g·kg-1 （confidence probability P=95%， k=2）. Conclusion： The purity of reference material and the fitting of standard working curve are the main sources of uncertainty， and these factors should be strictly controlled to improve the accuracy of detection results.

Keywords： uncertainty; sorbic acid; high performance liquid chromatography; litchi wine

荔枝酒是以新鲜荔枝为原料，经发酵或浸泡等工艺酿制而成的果酒[1]，其色泽晶莹，带有浓郁的荔枝果香[2]，口感醇厚甘甜，既保留了荔枝的风味，又增添了酒的韵味，是一款独具特色的饮品。受荔枝酒原料本身的热敏性、易褐变等因素的影响[3]，其易发生酸败影响口感，当前常在荔枝酒中添加适量的山梨酸以防腐保鲜[4]。山梨酸能抑制微生物生长，延长荔枝酒的保质期，防止酒在储存和运输过程中因微生物滋生而变质，能够确保产品在一定时间内保持较好的品质和口感。但山梨酸添加过量可能对人体产生危害[5]，如过敏反应、影响人体新陈代谢等[6-10]，

因此准确测定荔枝酒中的山梨酸含量可确保产品符合安全标准，保障消费者健康，而且有助于企业规范使用食品添加剂，促进荔枝酒行业健康发展。

为明确测定结果可靠程度及判断数据质量，本文依照《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》（GB 5009.28—2016）中高效液相色谱法，对荔枝酒中的山梨酸含量进行测定，并根据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012），对实验中各影响因素所引入的不确定度进行评定。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

荔枝酒样品，超市购买。

甲醇（色谱纯），天津市四友精细化学品有限公司；乙酸铵（优级纯），上海麦克林生化科技股份有限公司；实验用水为一级纯水，阿修罗超纯水机制备；水相微孔滤膜（0.22 μm）；水中山梨酸标准物质[浓度为1.00 mg·mL-1，编号为GBW（E）100007]，中国计量科学研究院。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（Ultimate 3000），美国赛默飞世尔公司；电子分析天平（FA2004），上海衡平仪器仪表厂；移液器，德国BRAND公司。

1.3 液相色谱条件

C18型色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇与乙酸铵溶液的混合液（5∶95，V/V）；紫外检测波长为230 nm；柱温为30 ℃；进样体积为10 μL；流速为1 mL·min-1。

1.4 样品前处理

根据《食品安全国家标准 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》（GB 5009.28—2016）第一法液相色谱法测定荔枝酒中山梨酸含量。准确称取2 g（精确到0.000 1 g）荔枝酒置于50 mL容量瓶中，用纯水定容至刻度线，充分摇匀后，移取适量的上清液，采用0.22 μm的水相微孔滤膜进行过滤，从而得到上机待测液。

1.5 山梨酸标准工作溶液的配制

准确移取2.0 mL浓度为1.00 mg·mL-1的山梨酸标准物质溶液，将其置于10 mL容量瓶中，用纯水定容至刻度线，制得浓度为0.2 mg·mL-1的山梨酸标准中间溶液。分别移取0.125、0.250、0.500、0.750、1.000 mL和1.250 mL的山梨酸标准中间溶液，依次置于5 mL容量瓶中，并用纯水定容至刻度线，配制成浓度分别为0.005、0.010、0.020、0.030、

0.040 mg·mL-1和0.050 mg·mL-1的标准系列工作溶液。

1.6 数学模型

按照GB 5009.28—2016中液相色谱法，计算荔枝酒中山梨酸含量的公式为

（1）

式中：X为荔枝酒样品中的山梨酸含量，g·kg-1；ρ为通过标准曲线确定的样品待测液中山梨酸的质量浓度，mg·L-1；V为样品的定容体积，mL；m为样品的称样量，g；1 000为换算因子。

1.7 不确定度来源

在测定荔枝酒中的山梨酸含量时，不确定度有诸多来源。①样品前处理引入的不确定度。②标准溶液配制引入的不确定度。③标准曲线拟合引入的不确定度。④样品重复性测量引入的不确定度。根据各种不确定度分量绘制来源因果分析图，如图1所示。

图1 不确定度来源因果分析图

2 结果与分析

2.1 样品前处理引入的相对标准不确定度

2.1.1 样品称量引入的不确定度

荔枝酒样品称量2.0 g，查检定证书，称量样品使用的电子天平（FA2004）的精准度为0.000 1 g，

偏载误差为±0.000 2 g，以均匀分布进行考量，k=。

则在称量过程中所引入的标准不确定度为

样品称量所引入的相对标准不确定度为

2.1.2 样品定容引入的不确定度

处理样品时，将摇匀后的样品用50 mL的A级容量瓶进行定容，根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）可知，50 mL容量瓶的允许误差为±0.05 mL，此时采用B类评定方法，按照均匀分布考虑，k=。

则样品定容引入的标准不确定度为

样品定容引入的相对标准不确定度为

2.1.3 样品在定容过程中温度变化引入的不确定度

实验室温度严格控制在（20±5）℃，即温度变化量ΔT为5 ℃。在实验过程中，所使用纯水的体积膨胀系数α取值为2.1×10-4 ℃-1，按照均匀分布考虑，k=。

使用50 mL容量瓶进行定容，则温度变化引入的标准不确定度为

温度变化引入的相对标准不确定度为

综合上述3个分量，荔枝酒样品在进行前处理时引入的相对标准不确定度为

2.2 标准溶液配制引入的相对标准不确定度

2.2.1 标准物质纯度引入的不确定度

本实验所使用的是水中山梨酸标准品，经查阅标准物质证书后得知，其浓度值为1.00 mg·mL-1，此标准品的相对扩展不确定度为2%，包含因子k=2。

则山梨酸标准物质纯度引入的相对标准不确定度为

2.2.2 配制标准中间工作液引入的不确定度

用移液器（规格为500～5 000 μL）移取2.0 mL山梨酸标准品至10 mL容量瓶中，用纯水定容至刻度线，配制成0.2 mg·mL-1的山梨酸标准中间工作液。查此移液器的检定证书，显示2.0 mL校准点对应的标准不确定度U=0.004 mL（k=2），考虑到移取的体积小，温度效应忽略不计。

则使用10 mL容量瓶定容配制标准中间工作液引入的相对标准不确定度为

2.2.3 配制标准系列工作曲线溶液引入的不确定度

用移液器（规格为100～1 000 μL）分别移取山梨酸标准中间溶液0.125、0.250、0.500、0.750、

1.000 mL和1.250 mL至5 mL容量瓶中，用纯水定容至刻度线，即可得到相应的各点标准系列工作曲线浓度。查此移液器的检定证书，因移液器采用多点校准方法进行检定，所以在移取不同体积时具有不同的标准不确定度。配制标准工作溶液过程中移液器引入的相对标准不确定度结果见表1。

根据表1中计算得到的各相对标准不确定度，考虑到移取的体积小，温度效应忽略不计，在此情况下，标准工作溶液配制过程中移液器引入的合成相对标准不确定度为

综合上述3个分量，山梨酸标准溶液在配制过程中所引入的相对标准不确定度为

2.3 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度

本实验配制了6个不同浓度梯度的山梨酸标准工作液，并对荔枝酒样品进行了6次平行测定。运用最小二乘法，对数据进行拟合操作，经拟合后得到标准工作曲线方程为y=1 175.5x-0.000 03，截距a=

-0.000 03，斜率b=1 175.5，线性相关系数为0.999 7。测得的峰面积与样品浓度结果见表2。

标准工作溶液峰面积残差的标准偏差以及线性拟合引入的标准不确定度计算公式分别为

（2）

（3）

式中：b为标准曲线斜率，b=1 175.5；p为被测样品的测定次数，p=6；n则是山梨酸标准系列溶液的测定次数，n=6；Ai为峰面积；Ay为标准峰计算值；为

荔枝酒样品浓度的平均值，=0.007 47 mg·mL-1；为山梨酸标准溶液浓度平均值，=0.025 8 mg·mL-1；Ci为系列标准溶液浓度值，mg·mL-1。