橙汁中脂环酸芽孢杆菌的微生物风险研究

摘 要：本文研究了酸土脂环酸芽孢杆菌在橙汁中的增殖性及杀菌能力。结果表明，酸土脂环酸芽孢杆菌在鲜果橙产品中是否增殖与温度有关。25 ℃时，酸土脂环酸芽孢杆菌在橙汁产品中不增殖，30、45 ℃条件下，酸土脂环酸芽孢杆菌在橙汁产品中会增殖。酸土脂环酸芽孢杆菌在橙汁产品中的D90 ℃=8.09 min，R2=0.991 8；D95 ℃=1.84 min，R2=0.996 7；D100 ℃=0.71 min，R2=0.994 5。根据目前果汁生产企业常采用的杀菌条件可知，酸土脂环酸芽孢经过杀菌后并不能完全被杀灭，在成品中仍然有残留。

关键词：橙汁；脂环酸芽孢杆菌；温度；耐热性

Study on the Microbiological Risk of Alicyclobacillus acidoterrestris in Orange Juice

SHAN Meng

（Shanghai Kangshi Food Technology Co.， Ltd.， Shanghai 201103， China）

Abstract： This article investigates the proliferation and bactericidal ability of Alicyclobacillus acidoterrestris in orange juice， the results showed that the proliferation of Alicyclobacillus acidoterrestris in fresh orange products was temperature dependent. At 25 ℃， Alicyclobacillus acidoterrestris did not proliferate in orange juice products， but at 30 ℃ and 45 ℃， it did. The D90 ℃=8.09 min and R2=0.991 8 of Alicyclobacillus acidoterrestris in orange juice products; D95 ℃=1.84 min， R2=0.996 7; D100 ℃=0.71 min， R2=0.994 5. According to the commonly used sterilization conditions in juice production enterprises， it is known that the Alicyclobacillus acidoterrestris cannot be completely killed after sterilization， and there are still residues in the finished product.

Keywords： orange juice; Alicyclobacillus acidoterrestris; temperature; heat resistance

脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）是一种嗜酸耐热性的芽孢菌，会污染苹果汁、橙汁等浓缩果汁及果汁饮料等[1-2]。果汁中的脂环酸芽孢杆菌最初来源于被土壤污染的原料果，虽然这类微生物本身不会对人体产生危害[3]，但由于其具有耐酸、耐热、产芽孢等特性，所以一旦污染生产线就不易被去除，会随生产线进入终产品中[4-7]。脂环酸芽孢杆菌在浓缩果汁中不能繁殖，但经稀释后，可以在果汁中增殖[8]，其细胞膜中含有比较罕见的ω-环状脂肪酸，这一特殊结构成为细胞膜的防护层，使其能在极端环境（如高温、低pH值条件）下生长繁殖[1-2，9-12]。脂环酸芽孢杆菌属中的酸土脂环酸芽孢杆菌在代谢时会产酸，但不影响果汁本身的pH值，仅在瓶子底部出现一定的浊度[13-14]，且菌体在代谢过程中会产生一些次级代谢产物，如愈创木酚（邻甲氧基苯酚）和卤酚，包括2，6-二溴苯酚（2，6-dibromophenol，2，6-DBP）以及2，6-二氯苯酚（2，6-Dichlorophenol，2，6-DCP）[15-17]。当菌体数量达到105～106 CFU·mL-1时，会产生明显的不愉快味道[18]。因此，在国际贸易中严格规定每10 mL浓缩果汁中脂环酸芽孢杆菌的含量不大于1个[19]。我国部分浓缩果汁中脂环酸芽孢杆菌数量严重超标，导致产品合格率较低，已成为当前困扰果汁生产企业的技术难题[17，20]。如何生产合格的、没有不愉悦气味的果汁是果汁生产企业迫切需要解决的问题，因此本文通过研究不同储藏温度下，橙汁饮料中酸土脂环酸芽孢杆菌的增殖情况及其耐热性，以期获得较佳的橙汁饮料生产及储存条件，为企业生产橙汁饮料提供指导性意见。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

酸土脂环酸芽孢杆菌从橙浓缩汁中分离鉴定而得；橙汁饮品，市售产品；YSG培养基，广东环凯微生物科技有限公司；琼脂粉，广东环凯微生物科技有限公司；基质辅助激光电离解析飞行时间质谱，德国布鲁克；1～1 000 μL移液器，Eppendorf；SQ510C型立式压力蒸汽灭菌器，Yamato；VORTEX-6涡旋振荡仪，其林贝尔；超净工作台，苏州净化设备有限公司；超净工作台，苏州净化设备有限公司；恒温水浴锅，德国Julabo；油浴锅，美国polyscience；恒温培养箱，德国Binder。

1.2 实验方法

本文先模拟橙汁产品的售卖环境温度及酸土脂环酸芽孢杆菌的最适生长温度进行25、30、45 ℃这3个温度下的增殖性测试。再根据耐热实验推算橙汁饮品中的酸土脂环酸芽孢杆菌的杀菌能力[21]。最后结合杀菌能力及酸土脂环酸芽孢杆菌在橙汁饮品中的增殖性，分析不同类别的橙汁饮品对原料中的酸土脂环酸芽孢杆菌的风险管控。

1.2.1 增殖性测试

（1）菌液制备及热处理。将分离纯化后得到的酸土脂环酸芽孢杆菌在YSG培养基平板上划线后[22]，置于45 ℃培养72 h，用无菌接种环取部分细菌，加入10 mL的YSG液体培养基中，涡旋混匀，制成菌悬液。将该菌悬液置于80 ℃水浴中10 min，将水浴后的菌悬液迅速置于冰水中冷却至室温，制成菌浓度约为1×107 CFU·mL-1的菌悬液。

（2）菌种反接及计数。将热处理后的菌悬液分别稀释10、100、1 000倍，各取200 μL菌液接种至市售成品橙汁中混匀，分别置于25、30、45 ℃保藏，每个温度每个梯度各10个平行。检测样品的初始含菌量，分别在0、2、3、4、7、14、21 d和28 d对反接菌样品进行取样检测。接种后样品中的酸土脂环酸芽孢杆菌的浓度分别为低浓度（0.1～1.0 CFU·mL-1）、中浓度（1.0～10.0 CFU·mL-1）、高浓度（10.0～100.0 CFU·mL-1）。

1.2.2 杀菌能力测试

（1）样品处理。芽孢菌液的制备。接种1.2.1中分离纯化后的酸土脂环酸芽孢杆菌到YSG培养基平板，45 ℃培养7 d，至产孢率在90%以上，用鲜果橙润洗平板，制备酸土脂环酸芽孢杆菌菌悬液，振荡混匀。将菌悬液置于90 ℃水浴15 min，迅速冷却，用安瓿瓶分装备用。

（2）菌液培养计数。将装有菌悬液的安瓿瓶分4组，每组不少于6支，其中1组不经过热处理，其余每组放置于预先设定好温度的恒温油浴中（90、95、100 ℃），分别处理一定时间后（每组至少5个时间点），取出后迅速置冰水浴内冷却5 min后取出，用灭菌纯化水进行梯度稀释，取1 mL稀释液倾注YSG平板，在37 ℃培养箱中培养过夜后计数。

（3）数据处理。D值通常指t温度（121 ℃）下杀灭90%的微生物所需杀菌时间，是微生物耐热的特征参数，D值越大，微生物的耐热性越强，通常在D的右下角标明具体试验温度。以热处理时间为横坐标、芽孢计数的对数值为纵坐标，拟合线性方程，并计算D值[23-24]。Z值是指某种微生物的D值变化90%时所需要改变的温度，单位为℃。通常以加热温度为横坐标，D值的对数值为纵坐标，所绘曲线斜率的负倒数就是Z值[23]。

2 结果与分析

2.1 增殖性测试结果

45 ℃保藏时，酸土脂环酸芽孢杆菌在样品中的浓度变化趋势见图1。可以看出，橙汁产品中加入不同浓度的酸土脂环酸芽孢杆菌后，样品中菌体的含量随保藏时间的延长呈上升趋势。3种不同浓度的酸土脂环酸芽孢杆菌菌悬液加入产品后即开始增殖，7 d后细菌浓度达到稳定，且稳定后的菌浓度几乎相同。30 ℃保藏时，酸土脂环酸芽孢杆菌在样品中的浓度变化趋势见图2。可以看出，30 ℃保藏的橙汁样品中酸土脂肪酸芽孢杆菌在4 d后开始增殖，并在14 d后达到相对稳定，菌浓度在105～106 CFU·mL-1。在低浓度的样本中，有50%的样本存在增殖情况，50%的样本中的细菌数量保持稳定，低浓度样本的浓度变化曲线是选取增殖的样本进行绘制。25 ℃（室温）保藏时，酸土脂环酸芽孢杆菌在样品中的浓度变化趋势见图3。可以看出，模拟室温条件下（25 ℃）保藏的样品在28 d内酸土脂环酸芽孢杆菌数量无明显变化。说明酸土脂环酸芽孢杆菌在25 ℃条件下如果存在于橙汁样品中，不会增殖。

2.2 不同温度下样品中菌浓度变化趋势

图4为不同保藏温度下，橙汁样品中加菌量为1.0～10.0 CFU·mL-1时的浓度变化曲线。25 ℃条件下保藏的橙汁样品中的酸土脂环酸芽孢趋于稳定，几乎不会增殖；30 ℃条件下保藏的橙汁样品中的酸土脂环酸芽孢杆菌在保藏4 d时开始进入对数生长期，在14 d时达到稳定期，菌浓度可以达到105 CFU·mL-1；45 ℃条件下保藏的橙汁样品中的酸土脂环酸芽孢杆菌在2 d时开始进入对数生长期，在7 d时达到稳定期，菌浓度可以达到105 CFU·mL-1。

2.3 杀菌能力测试结果

由图5可知，酸土脂环酸芽孢杆菌在橙汁产品中的D90 ℃=8.09 min，R2=0.991 8；D95 ℃=1.84 min，R2=0.996 7；D100 ℃=0.71 min，R2=0.994 5。

酸土脂环酸芽孢杆菌的耐热曲线见图6，耐热曲线为y=-0.105 5x+10.369，计算得Z值为9.48 ℃。假定杀菌前半成品中污染的微生物为酸土脂环酸芽孢杆菌，其耐热性如2.3所示。为保证果汁风味，果汁企业常采用巴氏杀菌方式对NFC鲜榨果汁进行杀菌，杀菌温度一般为80～100 ℃，杀菌时间为15～30 s[25-28]。由图5可知，D90 ℃=8.09 min，D95 ℃=1.84 min，D100 ℃=0.71 min；由得[29]，D80 ℃=91.79 min；D85 ℃=27.25 min；根据目前果汁生产企业的常采用的杀菌条件80～100 ℃，15～30 s，可知酸土脂环酸芽孢经过杀菌后并不能完全被杀灭，在成品中仍然有残留。

3 结论

本文使用从橙浓缩汁中分离出的酸土脂环酸芽孢杆菌，在橙汁中进行了增殖性实验及耐热实验。从增殖性实验结果可以看出，酸土脂环酸芽孢杆菌在鲜果橙产品中是否增殖与样品的保藏温度有关。25 ℃（室温）条件下保藏，橙汁样品中的酸土脂肪酸芽孢杆菌几乎不会增殖，对产品没有风险；在30 ℃保藏条件下，橙汁样品中的酸土脂肪酸芽孢杆菌有一定概率会增殖，对橙汁产品有一定风险；在45 ℃保藏条件下，橙汁样品中的酸土脂环酸芽孢杆菌会增殖，对橙汁样品的风险性非常高。

在耐热实验中，得到酸土脂环酸芽孢杆菌的耐热性数据为D90 ℃=8.09 min，D95 ℃=1.84 min，D100 ℃=0.71 min，耐热曲线为y=-0.105 5x+10.369，Z=9.48 ℃。通过计算可知，目前果汁常用的杀菌方式并不能有效地杀灭酸土脂环酸芽孢杆菌。如果想保证橙汁饮品不因酸土脂环酸芽孢杆菌造成风味变化，可以通过控制保藏温度来延长产品货架期。