动物源性食品中盐酸克伦特罗检测方法研究进展

摘 要：本文综述了动物源性食品中盐酸克伦特罗检测方法的最新研究进展，主要涉及色谱法、免疫分析法和生物传感器法等。这些方法在选择性、灵敏度、检测限和操作性等方面各有优劣，展开分析有助于为动物源性食品中盐酸克伦特罗的残留检测提供多种选择。

关键词：盐酸克伦特罗；氨哮素；克喘素

Research Progress on the Detection Method of Clenbuterol in Animal-Derived Foods

GUO Kuo

（Shenyang Center for Disease Control and Prevention， Shenyang 110100， China）

Abstract： This article reviews the latest research progress in the detection of clenbuterol in animal-derived foods， mainly involving chromatography， immunoassay and biosensor method. These methods have advantages and disadvantages in terms of selectivity， sensitivity， detection limits， and operability， and the expanded analysis can help provide a variety of options for the detection of clenbuterol residues in animal-derived foods.

Keywords： clenbuterol; ammonin; crebute

盐酸克伦特罗（Clenbuterol，CLB）又称氨哮素、克喘素。该药物作为β2受体激动剂，可引起交感神经兴奋，在治疗剂量下，具有松弛气管平滑肌作用，主要用于治疗支气管哮喘、慢性支气管炎等[1]。盐酸克仑特罗作为动物生长促进剂，极易在动物组织中形成残留，并通过食物链危害人类健康，因此20世纪80年代后期欧盟便颁布了相关禁用法规。我国原农业部于1997年明令禁止其作为饲料添加剂。从1999年开始，全国各地展开了针对克仑特罗等违禁兽药及饲料的专项整治行动。2002年2月9日，我国有关部门发布《禁止在饲料和动物饮水中使用的药物品种目录》，盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等甲状腺素受体激动剂被列入禁止在饲料及动物饮用水内使用的药品清单[2]。而到了2012年5月1日，根据《饲料和饲料添加剂管理条例》的规定，国务院农业行政部门所列明的任何物质，特别是β-受体激动剂，均被严禁添加到饲料中[3]。盐酸克伦特罗不仅严重危害人类身体健康，而且影响国内畜产品出口。因此，加强盐酸克伦特罗残留的检测工作显得十分重要。

1 盐酸克伦特罗的样品前处理

样品前处理在检测分析中是十分重要的。对样品中待测物进行有效提取是检测的前提，选择合适的提取条件可以最大限度地提取样品中的待测物并避免样品基质的干扰。盐酸克伦特罗的提取与净化方法主要有溶剂萃取、固相萃取、基质固相分散[4-5]等。目前样品中的盐酸克伦特罗多在酸性条件下提取，然后用固相萃取小柱净化。潘胜东等[6]基于混合阳离子交换固相萃取和液相色谱-串联质谱法测定肉样品中特布他林、沙丁胺醇、莱克多巴胺和克伦特罗残留量，用2%磷酸-甲醇水溶液（80∶20，V/V）涡旋提取10 min，离心分离。上清液首先经过乙酸处理以进行酸化，然后通过MCX混合阳离子交换固相萃取柱完成纯化流程，并利用液相色谱-串联质谱法进行定量分析。结果表明，在肉类样本中，特布他林、沙丁胺醇、莱克多巴胺和克伦特罗这4种β-受体激动剂的最低检出浓度（Levels of Detail，LOD）在0.03～0.08 μg·kg-1。

此外，液液萃取是传统的样品前处理技术，方法简便、快速，也常应用于盐酸克伦特罗的检测中。

2 盐酸克伦特罗的检测方法

2.1 免疫分析法

免疫分析法具有特异性高、灵敏度高、反应条件温和等优点，已广泛应用于盐酸克伦特罗等的检测。在盐酸克伦特罗的检测中，免疫分析法多用于样品的筛选，主要包括酶联免疫法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）和胶体金免疫层析法（Colloidal Gold Immunochromatography Assay，GICA）。酶联免疫法是通过酶标记的抗体来进行的抗原-抗体反应。酶凭借其独特的催化能力，能够驱动原本无色的底物发生水解、氧化或还原等一系列化学反应，进而产生明显的颜色变化。化学发光酶免疫测定法（Chemiluminescent Enzyme Immunoassay，CLEIA）融合了化学发光与酶联免疫技术，展现出高灵敏度、宽线性范围、简化快捷的分析流程及良好的稳定性等特点。王毅谦等[7]基于盐酸克伦特罗的竞争酶联免疫吸附测定法，通过优化反应温度、反应时间和缓冲体系pH值，建立了盐酸克伦特罗的CLEIA测定法。该方法的检测范围为0.043 3～42.536 3 μg·L-1，理论检测限为0.017 8 μg·L-1，变异系数小于10%，回收率为95%～110%，对莱克多巴胺和沙丁胺醇仅有极低的交叉反应性，且具有较高的精密度和准确度。胶体金免疫层析技术采用胶体金颗粒作为标记指示剂或颜色显现工具，在抗原与抗体的相互作用中发挥着关键作用。该技术因其操作简便、响应迅速以及高度敏感的特性，广受认可并被广泛应用于各种检测领域。张晓丽[8]应用胶体金读数仪法快速检测动物肌肉中的克伦特罗含量，在已知克伦特罗含量为0.94 ng·g-1的羊肉中测定出1.21 ng·g-1克伦特罗。

2.2 高效液相色谱法

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chroma-tography，HPLC）作为常见的分析检测手段，具有成本低、速度快、仪器设备简单的特点。该方法常用的检测器有紫外检测器、二极管阵列检测器[9]等。王琦等[10]改进了现有利用高效液相色谱仪检测动物性食品中克伦特罗残留量的国标方法，采用液-液萃取和固相萃取提取纯化样品，并简化了样品处理过程。结果表明，该方法的检测限为0.05 mg·kg-1，相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）为4.46%，回收率为88.0%～93.4%。GAO等[11]用氧化石墨烯中空纤维固相微萃取-HPLC测定牛肉中莱克多巴胺和克伦特罗，莱克多巴胺和克伦特罗的检测限分别为0.01 μg·mL-1和0.03 μg·mL-1，定量限分别为0.03 μg·mL-1和0.08 μg·mL-1，平均回收率分别为85.8%～109.8%和78.8%～101.4%。王韦岗[12]建立了固相萃取-HPLC测定蜂蜜中克伦特罗残留量的方法，并考察了流动相和固相萃取柱对蜂蜜中克伦特罗残留量测定结果的影响，发现以甲醇-磷酸盐为流动相时，杂质组分干扰少，方法重复性好，灵敏度较高，并具有良好的线性相关性。

2.3 气相色谱-质谱联用法

气相色谱-质谱联用法（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS/MS）实际上是将气相色谱仪和质谱仪联合在一起应用，具有快速、分离效果好、灵敏度高和选择性好等特点。但气相色谱要求待测样品具有低沸点、容易挥发的性质。盐酸克伦特罗本身的沸点较高，不易挥发，不能直接用气相色谱-质谱进行测定，需经过衍生化处理。常用的衍生化方法有硅烷化和环化衍生。岳韩笑等[13]采用同位素稀释质谱法，结合固相萃取技术，建立了猪肉中克伦特罗等4种β-受体激动剂残留量的气相色谱-串联质谱法。样品经β-盐酸葡萄糖醛苷酶与芳基硫酸酯酶酶解，随后采用醋酸铵缓冲液提取，并加入高氯酸调整至适宜pH值。之后，样品通过HLB-MCX固相萃取柱串联进行净化处理。净化完成后，样品会与N，O-双三甲基硅基三氟乙酰胺及含1%三甲基氯硅烷的溶液进行衍生化反应，再经由GC-MS/MS系统检测。结果表明，该方法的检测下限在0.13～0.40 μg·kg-1，定量下限在0.40～1.27 μg·kg-1。

2.4 液相色谱-串联质谱法

质谱仪灵敏度较高，可对未知化合物的结构进行定性分析。高效液相色谱-质谱联用技术结合了高效液相色谱的出色分离效能与质谱仪的高灵敏度、精确选择性等优势，在分析化学领域扮演着重要的角色。张可冬等[14]应用超高效液相色谱-串联质谱法测定肉制品中盐酸克伦特罗残留量的方法。样品经0.1 mol·L-1的高氯酸溶解提取，正己烷脱脂，将高氯酸提取液调节至pH=5.0后，采用PXC固相萃取柱净化。在电喷雾离子源正离子模式下采用多反应监测模式，克伦特罗检出限（信噪比≥3）为0.02 μg·L-1，方法的平均回收率为91.35%～102.42%，相对标准偏差（n=6）为1.14%～4.52%。师敬敬等[15]应用超高效液相色谱-串联质谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）法同时测定猪肉中盐酸克伦特罗、氯霉素和氯丙嗪残留量。样品用碱性乙酸乙酯萃取，省略固相萃取步骤。浓缩后，用乙腈和10 mmol·L-1醋酸铵以0.7 mL·min-1的流速梯度洗脱。在电喷雾电源正负离子模式下采用多反应监测模式，通过同位素稀释内标法定量。结果表明，3种药物质量浓度在0.2～20.0 μg·L-1时均表现出良好的线性关系，线性相关系数均不低于0.995。在添加水平为0.20～1.00 μg·kg-1时，各目标物质的回收率在75.0%～108.5%，方法的相对标准偏差小于10%，检出限均为0.1 μg·kg-1。

3 结语

盐酸克仑特罗作为动物生长促进剂，会在动物组织中形成残留，并通过食物链危害人类健康，因此对其进行检测尤为重要。目前，盐酸克伦特罗的样品前处理手段多为酸性条件提取后，用固相萃取小柱净化。其检测方法主要包括免疫分析法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法以及液相色谱-质谱联用法等。其中，免疫分析法多用于样品的筛选，气相色谱-质谱联用法由于需要衍生化而比较烦琐，而液相色谱-串联质谱法因其高灵敏度和高专属性等优势，成为确证的主要检测手段。

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