高效液相色谱法测定面包中丙酸及丙酸盐的含量

Determination of Propionic Acid and Propionates in Bread by High-Performance Liquid Chromatography

ZHANG Yu， LIU Ying* （Tianjin Institute of Food Safety Inspection Technology， Tianjin 30o308， China）

Abstract： In view of the serious matrix interference， poor repeatability， and difficulty in qualitative and quantitative determination of propionic acidand propionate in existing food detection methods，this study optimized the HPLC detection method for propionic acid and propionate in bread.The sample was mixed with water and 1mol⋅L^-1 phosphoric acid solution and then ultrasonically extracted. The pH value was adjusted to about 3. The supernatant was filtered through a microporous filter membrane and separated by a C₁₈ chromatographic column. Phosphoric acid aqueous solution and methanol were used as the mobile phase for gradient elution and the determination was performed bya diode array detector.The results showed that the detection limitof this method was （20 0.02g⋅kg^-1 ，the quantification limit was 0.08g⋅kg^-1 ，and the recovery rate was 91.5%～105.0% when the content of propionic acid and propionate was 0.08～2.50g⋅kg^-1 ，and the relative standard deviation was 2.29%～4.79% This method is simple and fast to operate，can efectively separate the target peak and impurity peak inthe bread matrix， and the determination results are accurate and stable.

Keywords： high-performance liquid chromatography; propionic acid; propionates; bread

丙酸是一种无色透明且具有一定腐蚀性的液体，带有刺激性气味，被广泛应用于饲料防腐和食品防腐领域[1]。相较于其他防腐剂，丙酸具有在酸性条件下抑制细菌与霉菌但不会抑制酵母菌的优势，因此面包工业通常在面包中添加丙酸及其钠盐、钙盐作为防腐剂，起到延长保质期的作用。国内外法规均批准丙酸及其钠盐、钙盐在面包制作工艺中的合法使用。

为保障消费者的健康，对食品添加剂进行严格的监督和标准化管理是确保食品安全的重要举措之一。2024年3月12日，国家卫生健康委员会网站公开发布了《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》（GB2760—2024），其中删除了脱氢乙酸及其钠盐在面包中的使用规定。随着新标准的实施，丙酸及其钙盐、钠盐因其安全可靠的特性成为面包生产企业替代脱氢乙酸及其钠盐的重要防腐添加剂被广泛使用。然而，过量食用丙酸及其钙盐、钠盐也会导致内分泌系统紊乱，从而引起相关的慢性疾病[2]。《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》（GB2760—2024）规定，面包中丙酸及其钙盐、钠盐的使用限量为不得超过 2.5g⋅kg^-1 。

现有测定食品中丙酸及其钙盐、钠盐的方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱质谱法。其中，气相色谱法和气相色谱质谱法前处理方法多采用液液萃取法，操作复杂且回收率较低，测定结果重复性差，故本研究采用高效液相色谱法进行检测。由于面包在生产加工过程中可能使用多种食品添加剂，除目标峰外还可能出现其他杂峰，如山梨酸、脱氢乙酸等均可以在相同色谱条件下出峰，影响对丙酸的定性定量。因此，本研究意在建立一种高效、准确的高效液相色谱法，以实现面包中丙酸及其钙盐、钠盐的定性定量分析，为市场监管和质量控制提供可靠保障。

1材料与方法

1.1仪器和试剂

Agilent1260高效液相色谱仪（配有紫外检测器或二极管阵列检测器），美国安捷伦公司；Milli-QIntegral5超纯水仪，美国默克密理博公司；MS204TS/02电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KQ-800B超声波水浴，昆山市超声仪器有限公司；CHT205R离心机，湘仪离心机仪器有限公司；JJ-2B组织捣碎机，常州金南仪器制造有限公司；101-3AB鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司； S210pH 计，梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司； 17765-Q 0.45μm 滤膜针头过滤器，德国赛多利斯集团。

丙酸标准品（CAS号：79-09-4），纯度 ⩾97% 磷酸（ H₃PO₄ ），色谱纯；甲醇，色谱纯，购自赛默飞世尔科技有限公司。

1.2标准溶液的配制

精准称取 0.1g 丙酸标准品于 10mL 容量瓶中，加水至刻度，配成浓度为 10mg⋅mL^-1 的丙酸标准贮备液， 4^∘C 冰箱中保存，有效期为6个月。

吸取丙酸标准贮备液 1mL 于 10mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，配制成浓度为 1mg^.mL^-1 的标准工作液，再从中分别吸取 0.08， 0.10， 0.20， 0.50， 1.00， （20号2.00mL 和 5.00mL 至 10mL 容量瓶中，分别加入1mol⋅L^-1 磷酸 0.2mL ，用水定容至 10mL ，混匀，得到浓度分别为0.008、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200mgmL^-1 和 0.500mgmL^-1 的丙酸标准系列溶液。

1.3 样品处理

取面包样品置于鼓风干燥箱中， 37^∘C 下干燥 2～ ³h ，置于组织捣碎机中磨碎。准确称取样品 5g ，置于 50mL 容量瓶中，加水约 20mL ，加入 1mol⋅L^-1 磷酸溶液 0.5mL ，混匀，经超声浸提 10min 后，用1mol⋅L^-1 磷酸溶液调节 pH 值至3左右，用水定容至刻度，摇匀。将试样全部转移至 50mL 具塞塑料离心管中，以 4000rmin^-1 离心 10min ，取上清液，经0.45μm 微孔滤膜过滤后，用液相色谱测定[3]。

1.4 色谱条件

色谱柱：SVEA C₁₈ Gold柱（ 250mm×4.6mm 5μm ）；柱温： 50°C ；流动相：A为 0.1% 磷酸水溶液，B为甲醇（色谱纯），梯度洗脱；流速：1mL⋅min^-1 ；检测波长： 214nm ；进样量： 20μL 梯度洗脱程序见表1。

2 结果与分析

2.1样品处理方法的选择

高效液相色谱法检测丙酸及其钙盐、钠盐含量的前处理方法主要分为蒸馏法和直接浸提法。本研究中，样品为面包，其基质复杂，除含有丙酸外，还含有淀粉、蛋白质、酵母等成分，在加热蒸馏时，这些成分可能会发生反应产生气体。例如，酵母在一定温度下可能会继续发酵或其他成分分解产生二氧化碳等气体，这些气体在液体中积聚，容易导致爆沸。因此，本研究选取直接浸提法进行实验。

面包水分含量较高，为验证其水分含量是否会影响丙酸检测结果，本研究对比了干燥和不干燥样的测定结果。将均质后的同一样品，一部分置于干燥箱中风干，另一部分直接进行前处理，每组分别进行6次平行重复实验。如表2所示，风干样品的相对标准偏差小于未风干样品，说明对样品进行干燥有助于提高检测结果的重复性。

2.2 流动相选择

面包在生产加工过程中可能使用多种食品添加剂，导致在检测中出现大量杂峰，如山梨酸、脱氢乙酸等，这些杂峰在相同色谱条件下与目标峰重叠，影响丙酸的定性定量分析。为了优化分离效果，本研究比较了两种流动相条件： 0.1% 磷酸水溶液 + 甲醇 =95+5 （V/V）和 0.1% 磷酸水溶液 + 甲醇 =90+10 （V/V）。

对面包基质加标样品进行色谱分析，色谱图见图1、图2。结果表明，流动相为 0.1% 磷酸水溶液 + 甲醇 =90+10 （V/V时，目标峰与杂质峰出现双峰现象，不能完全分离，分离度不能达到检测要求；流动相为0.1% 磷酸水溶液 + 甲醇 时，目标峰峰形较好，且能与杂质峰完全分离，达到定性定量的准确性要求。因此，本研究中选择 0.1% 磷酸水溶液 + 甲醇 作为流动相[4。考虑到面包基质较为复杂，所含添加剂种类较多，本研究 20min 后提高甲醇比例，加快杂质的洗脱。同时，采用梯度洗脱以减小杂质峰未洗脱完全对后续检测的影响。