响应面法优化羊奶果多酚提取工艺研究

Optimisation of Polyphenol Extraction from Elaeagnus Conferta Roxb. by Response Surface Methodology

XIA Xuefen1²， YANG Yilu1²， TIAN Sumei1，YANG Lanfen1²，DONG Shibin1 （1.DehongNormal University， Mangshi 67840o， China; 2.Dehong Biomedical Engineering Research Centre， Mangshi 678400， China）

Abstract： Using Elaeagnus conferta Roxb.as the raw material and polyphenol yield as the evaluation index， the response surface methodology was used to optimize the polyphenol extraction process of Elaeagnus conferta Roxb. based nsingle factor experiments.By analyzing the effects ofmaterial to liquid ratio，extraction temperature，ethanol volume fraction，and extraction time on polyphenol yield，the optimal extraction process parameters were determined to be a material to liquid ratio of 1：37（g：mL） ， extraction temperature of 80^∘C ，ethanol volume fraction of 72% and extraction time of 53min . Under these optimized conditions， the polyphenol yield of Elaeagnus conferta Roxb. can reach 15.3679% ：

Keywords： Elaeagnus conferta Roxb. polyphenols; response surface; extraction process

羊奶果（ElaeagnusconfertaRoxb.），又称南胡颓子或密花胡颓子，属于胡颓子科胡颓子属，是一种多年生常绿蔓状灌木。该植物多生长在热带雨林，广泛见于越南、马来西亚、印度等地，在我国则主要分布于广西南部以及云南的西双版纳、德宏等区域[。羊奶果不仅口感良好，还具有较高的食用价值，富含维生素、果胶、还原糖及氨基酸等多种有益成分[2]。相关研究表明，羊奶果成熟果实中富含多酚类物质、 β- 胡萝卜素和番茄红素[3]。多酚类化合物作为植物次生代谢产物，广泛存在于植物的各个器官中，包括花、果实、浆果、根、茎和叶[4。从食源性物质中提取的多酚具有较好的抗氧化、抗炎[5]和抗菌性能[，同时展现出抗肥胖、抗肿瘤和抗肝毒活性的功效[7]。本研究采用超声辅助提取法，探究不同因素对羊奶果成熟果实中多酚得率的影响，并基于单因素试验结果设计Box-Behnken响应面模型，以优选羊奶果多酚的最佳提取工艺。通过Box-Behnken模型试验数据，获得羊奶果多酚的最佳得率，为羊奶果多酚的进一步开发与利用提供参考依据。

1材料与方法

1.1 材料与试剂

羊奶果，市售；福林酚（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；无水碳酸钠（分析纯），西陇科学股份有限公司；无水乙醇（分析纯），西陇科学股份有限公司；浓盐酸（分析纯），山西潞安焦化有限责任公司；氢氧化钠（分析纯），国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

UPR-11-10T优普系列超纯水机，四川优普超纯科技有限公司；紫外可见分光光度仪，日本岛津；KQ-500DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；GM-0.33A隔膜真空泵，天津市津腾实验设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1羊奶果多酚提取工艺流程与操作要点

羊奶果分类 $$ 挑选 $$ 清洗 $$ 打浆均质 $$ 加乙醇溶液 $$ 超声提取 $$ 离心分离 $$ 定容 $$ 测定 $$ 计算羊奶果多酚得率。

精准称取 2g 的羊奶果果浆，将其置于 200mL 烧杯中。依据预先设定的料液比，向烧杯中加入相应体积比例的乙醇溶液。随后，使用保鲜膜密封烧杯口，并将烧杯置于超声恒温环境中，按照预设参数进行提取操作。提取完成后，将所得提取液转移至离心机中，以 3000r⋅min^-1 离心 10min 。离心后，取上清液定容后，进行测定，计算羊奶果多酚得率。

1.3.2 单因素试验

（1）料液比对羊奶果多酚得率的影响。称取羊奶果果浆 2g ，固定乙醇体积分数 60% 、提取温度80^∘C 、提取时间 40min ，考察料液比（ ）分别为 1：10，1：20，1：30，1：40，1：50 对羊奶果多酚得率的影响。

（2）乙醇体积分数对羊奶果多酚得率的影响。称取羊奶果果浆 2g ，固定料液比 1：40（g：mL ）、提取温度 80^∘C 、提取时间 40min ，考察体积分数分别为 20% 、 40% 、 60% 、 80% 和 100% 对羊奶果多酚得率的影响。

（3）温度对羊奶果多酚得率的影响。称取羊奶果果浆 2g ，固定乙醇体积分数 60% 、料液比1：40（Ωg：mL ）、提取时间 40min ，考察提取温度分别为50、60、70、 80^∘C 和 90^∘C 对羊奶果多酚得率的影响。

（4）提取时间对羊奶果多酚得率的影响。称取羊奶果果浆 2g ，固定乙醇体积分数 60% 、料液比 1： 2 10（g：mL ）、提取温度 80^∘C ，考察提取时间分别为20、30、40、 50min 和 60min 对羊奶果多酚得率的影响。

1.3.3 响应面优化试验

以单因素试验结果为基础，选择料液比（A）、乙醇体积分数 （B） 、提取温度 （C） 和提取时间（ |D| ）为考察因素，以多酚得率为响应值，开展响应面分析。响应面试验因素与水平见表1。

1.3.4多酚标准曲线绘制

在多酚含量测定过程中，采用福林酚法，并以没食子酸作为标准物质。具体操作步骤为用移液枪精准量取0、0.2、0.4、0.6、 1.0mL 和 1.5mL 的没食子酸标准储备液，分别置于 10mL 容量瓶中，接着使用体积分数为 60% 的乙醇溶液对各容量瓶进行定容处理，制备系列没食子酸工作液。随后，从上述装有不同浓度工作液的容量瓶中各取 1.0mL ，转移至 10mL 比色管中。并依次加入 2.5mL 福林酚试剂，充分振荡摇匀后，再加入 2.5mL15%Na₂CO₃ 溶液，最后加水定容至刻度线，并再次充分摇匀。将比色管置于 40^∘C 水浴环境中反应 60min ，取出后在室温下静置 20min 使其冷却。从而配制成浓度分别为0、4、8、12、 20mg^.L^-1 和 30mg^.L^-1 的标准系列溶液。采用分光光度法对上述溶液逐一进行检测，设定仪器波长为 778nm ，记录各溶液对应的吸光度。以没食子酸浓度为横坐标 ），吸光度为纵坐标（y） ，绘制没食子酸标准曲线，最终得到回归方程为y=0.04 1x+0.034 8 ，相关系数 R²=0.9953 。

1.3.5羊奶果多酚得率的测定

按照1.3.1提取工艺流程操作，取定容后的羊奶果上清液，用蒸馏水稀释100倍，于 778nm 波长处测定吸光度，并根据公式（1）计算羊奶果多酚得率。

羊奶果多酚得率

式中： C 表示通过标准曲线法得到的样品提取液中多酚浓度， mg⋅mL^-1 ； V 表示样品提取液的总体积，mL；100表示稀释倍数； M 表示羊奶果样品质量，g。

1.4数据处理

每组试验均重复3次，结果用平均值表示。使用Office2019对数据进行处理，采用Design-ExpertV8.0.6.1软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1单因素试验结果与分析

2.1.1 料液比对羊奶果多酚得率的影响

由图1可知，随着溶剂的增加，羊奶果多酚得率呈现先升高后降低的趋势，当料液比为1：40（Ωg：mL ）时，羊奶果多酚得率最高，这可能是由于增加溶剂后，溶剂渗透率提高。然而，在料液比为 1：50（g：mL 时，多酚得率逐渐下降，原因可能是一定比例的溶剂已将有效成分完全溶出，而过量的溶剂会导致细胞膜阻滞作用增强，同时使更多杂质溶解，进而影响多酚的提取率。因此，本试验中最佳料液比确定为 1：40（g：mL ）

2.1.2乙醇体积分数对羊奶果多酚得率的影响

由图2可知，随着乙醇体积分数的增加，羊奶果多酚得率呈现先升高后降低的趋势。当乙醇体积分数为 60% 时，多酚得率达到最高值，这表明 60% 乙醇能明显提高多酚提取率，可能原因在于此时多酚的扩散能力和溶解速率达到了最优状态。然而，随着乙醇体积分数的进一步升高，多酚得率逐渐下降，这可能是由于乙醇浓度过高时会导致一些非酚类化合物大量溶出，同时部分醇不溶物在高乙醇浓度条件下发生沉淀。此外，试验结果显示，当乙醇体积分数约为 60% 时，更有利于非水溶性和水溶性多酚的溶出。因此，综合考虑以上因素，本试验中最佳乙醇体积分数确定为 60% ○