超高效液相串联三重四极杆质谱法测定果冻中胭脂红酸

摘 要：建立了超高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪测定果冻中胭脂红酸含量的方法。样品通过盐酸水溶液酸化提取，并经过HLB固相萃取柱净化后，上机测定，基质外标法定量。胭脂红酸在5～200 ng·mL-1线性关系良好，相关系数＞0.999，方法的检出限为3.36 ng·g-1，定量限为11.21 ng·g-1。在不同浓度的加标水平下，回收率为91.2%～98.2%，相对标准偏差均＜2%。本方法污染小，操作简便，结果准确，适用于果冻中胭脂红酸的检测。

关键词：胭脂红酸；果冻；超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法

Determination of Carminic Acid in Jelly by Ultra High Performance Liquid Chromatography-Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometry

WANG Qiang

（Maanshan Institute for Food and Drug Control and Adverse Drug Reaction， Maanshan 243000， China）

Abstract： A method for the determination of carminic acid content in jelly using ultra high performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometer was established. The sample was acidified and extracted with hydrochloric acid aqueous solution， and after purification with an HLB solid-phase extraction column， it was measured on an instrument and quantified by the matrix external standard method. The linearity of carminic acid was good in the range of 5～200 ng·mL-1 with the correlation coefficient＞0.999. The limit of detection of the method was 3.36 ng·g-1， and the limit of quantification was 11.21 ng·g-1. The recoveries ranged from 91.2% to 98.2% at the spiked levels of different concentrations， and the relative standard deviations were all＜2%. The method is characterized by low contamination， simple operation， accurate results and suitable for the determination of carminic acid in jelly.

Keywords： carminic acid; jelly; ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry

胭脂红酸为胭脂虫红的主要成分[1]，具有蒽醌类结构[2]。胭脂虫红具有无毒、耐热、抗光和染色能力极强等特性，其应用涵盖食品、化妆品、医药等领域[3-5]。胭脂虫红虽为天然色素，但也会引发过敏和儿童多动症等不良反应[6]，因此对胭脂虫红的使用需要加强监督。目前检测胭脂红酸的方法有薄层色谱法[7]、毛细管电泳法[8]、高效液相色谱法[9]、超高效液相色谱串联三重四极杆质谱法（Ultra High Performance Liquid Chromatography-Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）[10]等。薄层色谱法、毛细管电泳法和高效液相色谱法对于复杂样品难以分离目标物，检测结果不准确[11]。目前UPLC-MS/MS法检测胭脂红酸仍有不足之处，如操作复杂、试剂耗材多、净化效果不理想等，对此本文优化了前处理方法和色谱条件，可以简单准确地检测胭脂红酸的含量，为市场监管提供的技术支持，保障食品安全。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Arium-Pro型纯水机，Sartori-us（德国）；ME204E/02型天平（万分之一），METTLER TOLEDO（瑞士）；T25型分散机，IKA（德国）；SepLine-S4型全自动固相萃取装置，莱伯泰科（美国）；DMT-2500型多管涡旋混合仪，米欧仪器（中国）；SHA-BA型水浴恒温振荡器，诺基仪器（中国）；N-EVAP5085型氮吹仪，Organomation（美国）；HC-3018型台式高速离心机，中科中佳（中国）；0.22 μm微孔滤膜，安谱（中国）；3500型超高效液相色谱仪串联三重四极杆质谱联用仪，AB（美国）。

1.2 材料与试剂

胭脂红酸标准物质，由DR提供；甲醇（质谱纯），赛默飞；盐酸（分析纯），阿拉丁；甲酸（质谱纯），赛默飞；实验室用水均为超纯水。

HLB固相萃取柱：200 mg、6 mL（60 μm）（纳谱科技），分别使用6 mL甲醇和6 mL水进行活化。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液配制

盐酸水溶液（2 mol·L-1）：量取84 mL盐酸至400 mL水中，混匀后，移入500 mL容量瓶中并用水定容至刻度线，摇匀。

胭脂红酸储备液（1.0 mg·mL-1）：称取0.100 0 g标准物质，用甲醇溶解，并用甲醇定容至100 mL，配制成质量浓度为1.0 mg·mL-1的标准储备溶液，4 ℃下避光保存。

胭脂红酸中间液（1.0 μg·mL-1）：移取100 μL 1.0 mg·mL-1胭脂红酸储备液，至100 mL容量瓶中，并用2%甲酸水溶液-甲醇（1+1，v/v）稀释并定容至刻度线。

胭脂红酸标准工作液：分别移取1.0 μg·mL-1胭脂红酸中间液5 μL、10 μL、50 μL、100 μL和200 μL至2 g（精确至0.000 1 g）的空白样品中，配成带基质的5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的胭脂红酸标准工作液。

1.3.2 样品前处理

（1）提取。称取2 g样品（精确至0.000 1 g）于50 mL离心管中，加入20 mL 2 mol·L-1盐酸水溶液，使用分散机10 000 r·min-1匀浆3 min后，于100 ℃振摇30 min。之后冷却至室温，超声提取10 min，10 000 r·min-1离心10 min，上清液移入100 mL容量瓶中。重复提取一次，合并上清液，用水定容至刻度，摇匀，备用。

（2）净化。准确移取10 mL上述备用液，至活化后的HLB固相萃取柱中，控制流速为1 mL·min-1，用12 mL水进行淋洗，抽干，用9 mL甲醇洗脱。洗脱液于40 ℃水浴中氮吹至近干，使用1.0 mL 2%甲酸水溶液-甲醇（1+1，v/v）进行复溶，过0.22 μm微孔滤膜，供UPLC-MS/MS上机测定，所得图谱见图1。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：C18柱（150 mm×3.0 mm，3 μm）；柱温：35 ℃；流速：0.5 mL·min-1；进样体积：10 μL；流动相A：0.3%甲酸水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱程序见表1。

1.3.4 质谱条件

扫描模式：负离子模式；监测模式：MRM；电喷雾电压：-4 500 V；离子源温度：650 ℃；雾化气压：55 psi；辅助气压：55 psi；气帘气压力：40 psi；碰撞气压力：9 psi。胭脂红酸的质谱参数见表2。

2 结果与分析

2.1 加热温度的选择

本文选择25 ℃、50 ℃、100 ℃ 3个温度作为加热提取的温度，按照1.3实验方法进行测定。

25 ℃、50 ℃、100℃盐酸水溶液的回收率分别为15%、50%、96%。依据回收率效果，选择100 ℃作为加热提取的温度。

2.2 固相萃取柱的选择

实验过程中比较聚酰胺SPE柱、混合型强阴离子SPE柱、HLB SPE柱3种固相萃取柱的净化效果，按照1.3实验方法进行测定。聚酰胺SPE柱、混合型强阴离子SPE柱、HLB SPE柱的回收率分别为32%、57%、96%。由于聚酰胺SPE柱和混合型强阴离子SPE柱的洗脱液分别用到氨水[11]和磷酸，在氮气浓缩的过程中，随着有机试剂的挥发，氨水和磷酸浓度增加，使得目标物分解从而导致回收率低下。依据回收率结果，选用HLB SPE柱作为净化柱。

2.3 流动相的优化

对比了甲酸水-酸化乙腈、乙酸铵-甲醇、甲酸水-甲醇作为流动相对待测物的影响，结果表明3种流动相对胭脂红酸色谱峰形、响应值、分离度的影响较小，从试剂的毒性和配制方便性考虑，最终选择甲酸水-甲醇作为本次实验的流动相。

2.4 方法的线性范围、检出限、定量限

胭脂红酸在5～200 ng·mL-1浓度范围内与峰面积具有良好的线性关系，回归方程为y=3 548.918 35x+5 674.592 75，相关系数＞0.999。以3倍S/N（信噪比）和10倍S/N（信噪比）对应的含量作为方法的检出限和定量限，得到本方法的检出限为3.36 ng·g-1，定量限为11.21 ng·g-1。

2.5 方法的准确度和精密度

如表3所示，对空白样品进行3个水平的加标，样品在50.0 ng·g-1、100.0 ng·g-1、250.0 ng·g-1加标水平下，回收率为91.2%～98.2%，相对标准偏差为0.70%～1.80%（n=6），表明方法的精密度和准确度良好，满足方法要求。

3 结论

本文采用盐酸水溶液酸化提取色谱样品，HLB SPE小柱净化、浓缩，建立了超高效液相色谱串联三重四极杆质谱联用法测定果冻中胭脂红酸的分析方法。本方法有机试剂用量少、操作简便、结果准确，不仅为市场监管提供了技术支持，保障人们的食品安全，也为食品生产企业胭脂红酸质量控制提供了参考。

参考文献

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