蜂胶软胶囊中总黄酮测定方法的改进

摘 要：蜂胶中富含大量总黄酮类化合物，黄酮类化合物具有丰富的药理作用。对蜂胶软胶囊参照GB/T 20574—2006检测时，加入显色剂用水定容后，溶液变浑浊，影响分光光度计吸光度测定的稳定性，本文对其前处理条件、定容溶液、显色时间进行优化，并对方法标准曲线、重复性、加标回收率进行验证。结果表明，在415 nm处，以芦丁为标准品，在含量为0.2～1.2 mg时呈现良好的线性关系，线性回归方程为y=0.734 1x-0.005 6（R=0.999 8），相对标准偏差为0.9%，加标回收率为92.0%～97.0%。

关键词：蜂胶软胶囊；总黄酮；分光光度法

Improvement of the Determination Method for Total Flavonoids in Propolis Soft Capsules

ZHOU Lu1，2， HUANG Ting1，2， DONG Yao1，2

（1.Jiangsu Provincial Productivity Promotion Center， Nanjing 210001， China;

2.Jiangsu Provincial Physical and Chemical Testing Center， Nanjing 210001， China）

Abstract： Propolis is rich in a large amount of total flavonoids， which have rich pharmacological effects. When testing propolis soft capsules with reference to GB/T 20574—2006， the solution became turbid after adding a colorimetric agent to a constant volume of water， which affected the stability of the spectrophotometer absorbance measurement. The pre-treatment conditions， constant volume solution， and colorimetric time were improved， and the method standard curve， detection limit， repeatability， and spiked recovery rate were verified. The results showed that at 415 nm， the content of rutin was 0.2～1.2 mg， and the linear regression equation was y= 0.734 1x-0.005 6 （R=

0.999 8）， the relative standard deviation was 0.9%. The recoveries were 92.0% ～ 97.0%.

Keywords： propolis soft capsules; total flavonoids; spectrophotometry

蜂胶是由蜜蜂，特别是工蜂，从植物的树胶、树脂中采集，并与上颚腺、蜡腺等分泌物混合形成的具有黏性的固体胶状物[1]。现代研究结果表明，蜂胶含有维生素、酚类、蓓烯类、黄酮类化合物等多种营养保健成分。在蜂胶的众多活性物质中，黄酮类物质是最为关键的成分之一，它具有抗菌、杀毒、消炎止痛、降血脂、促进机体组织再生和增强机体免疫能力等功效[2]。

近年来，蜂胶产品在市场上受到了广泛的关注和认可，其种类也日益丰富，主要以胶囊形式呈现。蜂胶中主要活性成分为黄酮类化合物，已成为研究热点，且市售的蜂胶胶囊类产品均以总黄酮含量作为评价指标[3]。黄酮类化合物的测定有多种方法，如液相色谱法﹑分光光度法等，液相色谱法可以测定单一的黄酮成分，分光光度比色法可以测定黄酮成分的总量[4-5]。紫外分光光度法被广泛应用于测定蜂胶制品中的总黄酮含量，因为它具有操作简便、准确度高且易于实施的特点，因此深受广大研究者的青睐。

1 材料与方法

1.1 试剂

芦丁标准品（含量95.5%，上海安谱璀世标准技术服务有限公司，批号2251131）；无水乙醇、硝酸铝、95%乙醇、醋酸钾（分析纯，南京化学试剂有限公司）。

1.2 仪器

UV-1801紫外-可见分光光度计（北京瑞利分析仪器有限公司）；KH2-250DB超声波清洗仪（昆山禾创超声仪器有限公司）；TGL-15B高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；BT25S十万分之一电子天平、BSA224S-CW电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。

1.3 实验方法

根据《蜂胶中总黄酮含量的测定方法 分光光度比色法》（GB/T 20574—2006），利用分光光度比色法对蜂胶软胶囊中的总黄酮进行定量分析。

1.3.1 试样的制备

称取蜂胶软胶囊内容物0.5 g（精确至1 mg）于烧杯中，加入95%乙醇约30 mL，室温下超声提取20 min，将溶液转移至50 mL的容量瓶中，加入95%乙醇至刻度线，混合均匀后进行过滤，弃去初滤液，收集滤液待测。

准确吸取1.0 mL待测溶液于50 mL容量瓶中，分别加入1.0 mL硝酸铝溶液和1.0 mL醋酸钾溶液，加95%乙醇至刻度，摇匀，静置10 min，3 000 r·min-1离心3 min，取上清液待测。

空白实验精密吸取1.0 mL待测溶液于50 mL容量瓶中，加95%乙醇至刻度，摇匀。用1 cm比色皿，在415 nm以空白试液作参比，测定样品吸光度。

1.3.2 标准溶液制备

称取10.50 mg芦丁标准品（含量95.5%）于50 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解，并定容至刻度，摇匀，溶液浓度为0.2 g·L-1。吸取标准溶液0 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL和6.00 mL（相当于芦丁含量0 mg、0.2 mg、0.4 mg、0.6 mg、0.8 mg、1.0 mg和1.2 mg），分别置于50 mL容量瓶中，向容量瓶中加入1.0 mL硝酸铝溶液和1.0 mL醋酸钾溶液，用95%乙醇定容至刻度，摇匀，静置10 min后测定。

1.3.3 结果计算

总黄酮计算公式为

式中：X为黄酮类化合物的总含量，%；m1为由标准曲线上查出测定液中芦丁质量，mg；m为样品的质量，g；d为稀释比例。计算结果表示到小数点后两位。

2 结果与分析

2.1 试样前处理方法的改进

国标方法中称取样品0.5 g，置于烧杯中，加入95%乙醇约30 mL，然后将烧杯置于65 ℃水浴中加热45 min，搅拌使之溶解，国标前处理时间较长。本文分别研究了室温下不同超声提取时间、振荡提取时间对实验结果的影响。结果表明，当超声提取时间分别为5 min、20 min、40 min时，总黄酮测定结果分别为7.53%、7.70%、7.68%；振荡提取时间分别为5 min、20 min、40 min时，总黄酮测定结果分别为7.34%、7.52%、7.65%。通过对比，超声提取5 min，提取不完全，总黄酮测定结果偏小，超声提取20 min和40 min的测定结果差别不大；振荡提取时间越长，提取越完全，测定结果越高；且相同时间下，超声提取比振荡提取效果好、测定结果高。因此，考虑时间、操作简单快捷等因素，实验采用超声提取20 min。

2.2 样品显色溶液的改进

按国标方法测定时，溶液出现浑浊，摇匀后出现较多小气泡，比色时吸光度不稳定，分光光度法测定时需溶液澄清透明。尝试将浑浊样液用滤纸过滤，发现过滤后溶液仍然不澄清，又尝试将溶液离心，均不能得到澄清透明的测定液。最后本文将国标加水稀释至刻度，改为加95%乙醇稀释至刻度，溶液比加水至刻度更加浑浊，离心后，离心管底部有大量白色沉淀，溶液澄清透明，可直接用于比色。国标法与改进后吸光度稳定性对比详见表1，发现改进后吸光度值更稳定。

2.3 显色时间的改进

国标方法摇匀后需静置1 h，时间较长，本文研究了不同显色时间对吸光度的影响。选取标准曲线0.6 mg单点，分别在显色时间2 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min和60 min进行吸光度测定，吸光度详见表2，发现10 min后吸光度值趋于稳定，所以将显色时间改为10 min。

2.4 方法确认实验

2.4.1 标准曲线

以芦丁含量为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y），得到线性回归方程为y=0.734 1x-0.005 6，相关系数R=0.999 8。由表3可知，芦丁质量在0.2～1.2 mg，与溶液的吸光度值有着良好的线性关系。

2.4.2 方法重复性和加标回收率实验

（1）重复性测定。称6份试样，按改进后的方法进行测定，结果详见表4。6次总黄酮含量测定的平均值为7.69%，相对标准偏差为0.9%，RSD值≤5%，方法重复性良好。

（2）加标回收率实验。称取蜂胶软胶囊样品3份，分别加入一定量的芦丁标准品，使样品中总黄酮含量增加0.5%、1.0%、3.0%，结果详见表5，加标回收率为92.0%～97.0%，满足实验分析要求。

3 结论

分光光度法对设备要求简单、具有较好的稳定性，易于推广普及。通过对国标方法的前处理条件、定容溶液、显色时间进行改进，研究并确定检测蜂胶软胶囊中总黄酮含量的最佳方法。将蜂胶软胶囊内容物超声提取20 min，用95%乙醇定容，显色10 min后，离心后测定，方法准确度高、重现性好、操作简便，结果可靠，可用于蜂胶软胶囊中总黄酮的测定。

参考文献

[1]陆婷婷，刘小玉，汪玉玲.等.高效液相色谱法测定蜂胶软胶囊中白杨素和高良姜素的含量[J].食品安全质量检测学报，2020，11（11）：3649-3653.

[2]王光新.北方部分地区蜂胶成分分析及抗糖尿病机理的研究[D].南京：南京农业大学，2011.

[3]张爱武.蜂胶胶囊中总黄酮提取方法的优化与研究[J].黑龙江八一农垦大学学报，2019，31（6）：46-51.

[4]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.蜂胶中总黄酮含量的测定方法 分光光度比色法：GB/T 20574—2006[S].北京：中国标准化管理委员会，2006.

[5]杨欢，刘越，杜旭刚.等.荞麦及其制品中总黄酮含量测定的方法筛选[J].食品安全质量检测学报，2021，12（8）：3313-3320.

作者简介：周璐（1990—），女，江苏南京人，本科，工程师。研究方向：食品安全分析测试。