3种硫酸多糖的酶抑制作用研究

摘 要：硫酸多糖具有抗凝血、抗病毒、抗菌、抗癌及促进创伤愈合等多种生物活性，且能抑制生物体内存在的各种酶的过度活性，有效维持生命健康和防止衰老。本文对褐藻糖胶（Fucoidan，FPS）、紫菜多糖（Porphyran，PP）、硫酸软骨素（Chondroitin Sulfate，CS）等3种硫酸多糖抑制透明质酸酶（Hyaluronidase，HAase）、胶原蛋白酶（Collagenase，CLS）、酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）和弹性蛋白酶（Elastase，PPE）的活性作用进行了研究。结果表明，FPS对HAase、CLS、PPE均有抑制作用；PP和CS对HAase、PPE有较强抑制作用，其中CS具有极强的HAase抑制活性；硫酸多糖抑制HAase活性作用可能与硫酸基有关，需进一步验证；多糖分子量越小，其抑制HAase活性作用越大。本研究有望为硫酸多糖在保湿护肤、抗黑色素生成、维持肌肤弹性等方面的开发利用提供参考。

关键词：硫酸多糖；褐藻糖胶；紫菜多糖；硫酸软骨素；酶；抑制作用

Research on Enzyme Inhibition of Three Types of Sulfated Polysaccharides

ZHANG Yang

（Wuhu Institute of Technology， Wuhu 241003， China）

Abstract： Sulfated polysaccharides exhibit a range of biological activities， including anticoagulation， antivirus， antibacterial， anticancer， and promotion of wound healing， as well as inhibiting the excessive activity of various enzymes within living organisms， effectively maintaining life health and preventing aging. This paper investigates the inhibition of three sulfated polysaccharides-fucoidan （FPS）， porphyran （PP）， and chondroitin sulfate （CS） on the activity of hyaluronidase HAase， collagenase （CLS）， tyrosinase （TYR）， and elastase （PPE）. The results indicate that FPS exhibits inhibitions on HAase， CLS， and PPE; PP and CS have strong inhibitions on HAase and PPE， with CS showing particularly strong inhibitory activity against HAase. The activities of sulfated polysaccharides on HAase may be linked with sulfates， which requires further verification; it has been observed that the smaller the molecular weight of the polysaccharides， the greater their inhibition on HAase activity. This research is expected to provide a reference for the development and utilization of sulfated polysaccharides in aspects such as moisturizing skincare， anti-melanin production， and maintaining skin elasticity.

Keywords： sulfated polysaccharides; fucoidan; porphyrin; chondroitin sulfate; enzyme; inhibition

硫酸多糖（Sulfated Polysaccharides）广泛存在于生物界[1]，在动物界以肝素（Heparin）、硫酸皮肤素（Dermatan Sulfate）等形式存在于动物组织中，在植物界以硫酸鼠李糖（Rhamnan Sulfate）等形式存在于各类海藻中。硫酸多糖具有多种生理作用，如抗病毒和抗菌作用[2-3]、抗癌作用[4]、促进创伤愈合作用[5]等，可应用于食品添加剂（如凝胶剂）、药物治疗（如抗凝血剂）及化妆品（如保湿特性）等领域。本文对褐藻糖胶（Fucoidan）、紫菜多糖（Porphyran）、硫酸软骨素（Chondroitin Sulfate）等3种硫酸多糖的酶活性抑制作用进行探究。其中，褐藻糖胶是一种膳食纤维[6]，存在于海带、裙带菜和海蕴等褐藻的黏液中，在海参和其他动物体内也有类似物质，该化合物主要由数万至数十万个以α-1，2键和α-1，4键连接的L-岩藻糖组成，平均分子量约为200 000；紫菜多糖是一种以半乳糖为基本单位，存在于紫菜属红藻中的硫酸多糖，具有增稠、消炎和增强免疫力等功效[7]；硫酸软骨素是一种存在于动物体内的糖胺聚糖，在软骨细胞外基质中的含量特别高，也广泛存在于结缔组织中（如皮肤、大脑和其他组织），大多数以蛋白聚糖的形式存在于细胞外基质和细胞表面[8]。研究中使用的酶包括透明质酸酶（Hyaluronidase）、胶原蛋白酶（Collagenase）、酪氨酸酶（Tyrosinase）和弹性蛋白酶（Elastase）。通过探究硫酸多糖对酶的抑制作用，以期为天然提取的硫酸多糖在食品药品行业和化妆护肤品行业的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

褐藻糖胶（F5631，西格玛公司）；紫菜多糖（S29753，源叶生物科技公司）；硫酸软骨素（C9819，西格玛公司）；透明质酸酶（H3885，西格玛公司）；Compound 48/80（C2313，西格玛公司）；胶原蛋白酶（C1889，西格玛公司）；酪氨酸酶（T3824，西格玛公司）；弹性蛋白酶（E7885，西格玛公司）；HEPES（赛默飞世尔科技公司）；其他所用试剂均为分析纯。

电子天平BS 124S（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；超声波清洗机XO-3200DT（南京先欧仪器制造有限公司）；台式高速离心机TG16-W（长沙湘智离心机仪器有限公司）；RE-85Z旋转蒸发器（上海青浦沪西仪器厂）；恒温振荡器HZ-C（太仓市实验设备厂）；高速大容量冷却离心机7780Ⅱ（日本久保田公司）；紫外可见分光光度计UV-1800（日本岛津公司）。

1.2 方法

1.2.1 多糖分子量测定

连接装有Toyopearl HW-60和Toyopearl HW-70的色谱柱，将其浸入30 ℃的恒温水浴中，用0.2 mol·L-1氯化钠作为洗脱液，以1.3 mL·min-1的流速进行凝胶渗透色谱分析。使用分子量分别为1 220 000、720 000、340 000、107 000、20 000和6 100的普鲁兰多糖Shodex STANDARD P-82作为标准样品，以分子量为纵坐标，保留时间为横坐标，绘制多糖分子量标准曲线（图1）。各硫酸多糖样品的浓度均为1.0 mg·mL-1，根据标准曲线以普鲁兰当量测得多糖分子量。

1.2.2 多糖硫酸基含量测定

精确称取多糖样品10 mg于试管中，加入1 mol·L-1 HCl 2 mL，在沸水中水解5 h；在60 ℃下减压浓缩，干燥并凝固，加入少量超纯水，重复干燥过程5次；再将凝固物溶解在10 mL超纯水中，制得硫酸多糖样品溶液。往0.5 mL样品溶液中加入99%浓度乙醇2 mL；再加入BaCl2缓冲液1 mL、玫棕酸钠溶液1.5 mL，充分搅拌后在室温下避光放置10 min；于520 nm波长下测定溶液吸光度。以Na2SO4为标样，配制硫酸基浓度为0 μL·mL-1、9.6 μL·mL-1、19.2 μL·mL-1、28.8 μL·mL-1、38.4 μL·mL-1、48.0 μL·mL-1的标准溶液，测量吸光度。以硫酸基浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制硫酸基含量标准曲线（图2）。

1.2.3 硫酸多糖抑制酶活性试验

（1）透明质酸酶活性抑制试验。参考MAEDA等[9]和KAKEGAWA等[10]的方法，将50 μL透明质酸酶溶液（4.0 mg·mL-1）添加至100 μL硫酸多糖样品（0.7 mg·mL-1），空白组添加0.1 mol·L-1乙酸缓冲液至样品；37 ℃下恒温振荡反应20 min；添加100 μL活化剂Compound 48/80溶液（0.5 mg·mL-1），同样37 ℃下恒温振荡反应20 min；继续添加250 μL透明质酸钠溶液（0.8 mg·mL-1），37 ℃下恒温振荡反应40 min；继续添加0.4 mol·L-1氢氧化钠溶液100 μL后反应中止；再添加0.8 mol·L-1硼酸溶液100 μL，水浴沸煮3 min；用冰水急速冷却至室温后，继续添加p-DABA溶液3 mL，37 ℃下恒温振荡反应20 min；于585 nm波长下测定溶液吸光度。同时以0.7 mg·mL-1色甘酸（Cromolyn）为标准物质做对照试验。硫酸多糖抑制透明质酸酶活性的计算公式为

式中：S为硫酸多糖样品的吸光度值；SB为样品空白的吸光度值；C为对照组的吸光度值；CB为空白对照的吸光度值。

（2）胶原蛋白酶活性抑制试验。将50 μL胶原蛋白酶溶液（0.1 mg·mL-1）添加至50 μL硫酸多糖样品（1.0 mg·mL-1），空白组添加超纯水至样品；继续添加400 μL 0.5 mmol·L-1多肽（Pz-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg）；37 ℃下恒温振荡反应40 min；添加1 mL 25 mmol·L-1柠檬酸溶液后反应中止；继续添加5 mL乙酸乙酯，激烈振动试管，再用离心机3 000 r·min-1离心分离10 min；取乙酸乙酯层于320 nm波长下测定溶液吸光度。同时以25 mmol·L-1（9.3 mg·mL-1）EDTA为标准物质做对照试验。硫酸多糖抑制胶原蛋白酶活性按公式（1）计算。

（3）酪氨酸酶活性抑制试验。往0.9 mL硫酸多糖样品（1.0 mg·mL-1）中添加300 μL酪氨酸溶液（0.3 mg·mL-1），继续添加1 mL 0.1 mol·L-1磷酸缓冲液（pH 6.8）；37 ℃下恒温振荡反应10 min；再添加100 μL酪氨酸酶溶液（5 000 U·mL-1），其中，空白组添加磷酸缓冲液；37 ℃下恒温振荡反应40 min；继续添加50 μL 2 mol·L-1叠氮化钠溶液后反应中止，冰水急速冷却至室温后，于475 nm波长下测定溶液吸光度。同时以5 mmol·L-1（0.71 mg·mL-1）曲酸（Kojic Acid）为标准物质做对照试验。硫酸多糖抑制酪氨酸酶活性按公式（1）计算。

（4）弹性蛋白酶活性抑制试验。向96孔分析微板加样50 μL硫酸多糖（1.0 mg·mL-1），继续添加25 μL弹性蛋白酶溶液（6 μg·mL-1），其中，空白组添加0.1 mol·L-1 HEPES缓冲液；将分析微板放置在4 ℃冷藏柜中反应15 min；从冷藏柜拿出后继续添加25 μL 8 mmol·L-1合成基质（MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA），室温下放置反应30 min；于405 nm波长下测定溶液吸光度。同时以5.4 μg·mL-1弹性蛋白（Elastin）为标准物质做对照试验。硫酸多糖抑制弹性蛋白酶活性按公式（1）计算。