银耳多糖抑菌效果研究

摘 要：采用抑菌圈试验检测古田银耳多糖对5种常见致病菌的抑菌效果，结果表明，1.87 µg·mL-1银耳多糖溶液对铜绿假单胞菌、乙型副伤寒沙门菌、大肠埃希菌均有一定的抑制作用，但是1.87～151.42 µg·mL-1银耳多糖溶液对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌均无明显的抑制作用。

关键词：抑菌圈试验；古田银耳；致病菌；抑菌效果

Research on the Antibacterial Effect of Polysaccharides from Tremella fuciformis

SONG Yang， PAN Lixiu， CHEN Jie， GUO Linkai， SONG Dongxiao， HUANG Xunrui*

（Ningde Center for Food and Drug Control， Ningde 352100， China）

Abstract： The antibacterial effect of Gutian Tremella fuciformis polysaccharides on five common pathogenic bacteria was tested using the antibacterial circle test. The results showed that a 1.87 µg·mL-1 Tremella fuciformis polysaccharide solution had a certain inhibitory effect on Pseudomonas aeruginosa， Salmonella paratyphi B， and Escherichia coli， but a 1.87～151.42 µg·mL-1 Tremella fuciformis polysaccharide solution had no significant inhibitory effect on Staphylococcus aureus and Candida albicans.

Keywords： antibacterial circle test; Gutian Tremella fuciformis; pathogenic bacteria; bacteriostatic effect

银耳（Tremella fuciformis），也称白木耳、雪耳等，是担子菌门真菌银耳的子实体，颜色多为白色或淡黄色，呈叶状、凝胶状，分布广泛，特别是在热带地区，常见于阔叶树的腐木上，在我国福建省、浙江省、广东省、安徽省、四川省和江苏省等地多有分布[1-2]。银耳营养素丰富，多糖、膳食纤维、蛋白质含量高，能量低，还含有钙、钠、硫、磷、镁、铁和钾等多种微量元素，越来越受到人们的喜欢[3]。福建省古田县是目前全国最大的银耳商品生产基地和开发品种最齐全的食用菌生产基地县[4]，2004年6月“古田银耳”获得“中国地理标志保护产品”荣誉称号[5]。

铜绿假单胞菌是一种可引起烧伤感染、肺炎、肠炎和脑膜炎的致病菌，且容易引起院内感染[6-7]；乙型副伤寒沙门菌容易引起急性胃肠炎或腹泻等肠道疾病[8-9]；大肠埃希菌是人肠道中正常存在的条件性致病菌，其某些血清型能产生肠毒素，具有致病性[10]；金黄色葡萄球菌是引起感染和危及生命的主要病原体[11]；白色念珠菌是真菌感染常见致病菌，也容易导致院内获得性念珠菌感染[12-13]。

银耳多糖是一种以甘露糖为主，包含鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、木糖和岩藻糖的酸性杂多糖，含量占银耳的60%～70%，是银耳中重要的活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、降血脂、降血糖和调节免疫等作用[14-16]，本文进一步研究了银耳多糖在抑菌方面的作用，以期扩宽银耳多糖的应用范围。

1 材料和方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料

银耳，购自福建古田县戴氏果蔬专业合作社。

1.1.2 试剂

大肠埃希菌（产品号：33053，批号：230506）、金黄色葡萄球菌（产品号：33025，批号：230418）、铜绿假单胞菌（产品号：33034，批号：230223）、白色念珠菌（产品号：33045，批号：230302）、乙型副伤寒沙门菌（产品号：33307，批号：230209），以上5种菌株均购自北京三药科技有限公司。胰酪大豆胨液体培养基（批号：2212202，北京三药，TSB培养基，）；胰酪大豆胨琼脂培养基（批号：221019，北京三药，TSA培养基）；沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：220620，北京三药，SDA培养基）；氯化钠（NaCl，批号：20220514，国药集团）；硫酸庆大霉素注射液（批号：20061001，山东鲁抗医药集团）；氟康唑片（批号：21121541，扬子江药业）；0.22 µm无菌PES膜（天津市领航）；空白药敏纸片（规格：直径6.0 mm，厚1.0 mm，山东百世微生物）；石油醚（30～60 ℃）（国药集团）；无水乙醇（国药集团）。

1.1.3 仪器设备

MLS-3751L-PC型高压蒸汽灭菌器（日本三洋电子）；DKM410C型鼓风烘干箱（重庆雅马拓）；HFsafe-1200型生物安全柜（上海力申）；UV2600i型紫外分光光度计（岛津）；GNP-9270型隔水氏恒温培养箱（上海精宏）；DensiCHEK Plus型电子比浊仪（生物梅里埃）；YP3002型电子天平（余姚金诺）。

1.2 试验方法

1.2.1 银耳多糖的提取

将购买的银耳子实体分散后，置于50 ℃烘箱烘干至水分含量在5.0%以内，粉碎过40目筛。以料液比1∶4（m/v）加入石油醚，充分振荡2 h后真空抽滤。滤渣中加入料液比1∶2（m/v）无水乙醇，充分搅拌12 h。沉淀用无水乙醇洗涤2次后，45 ℃ 烘干得脱脂后的银耳粉末，装棕色广口瓶-20 ℃ 储存备用[17]。将上述银耳粉经热水浸提后取上清液定容至50 mL，稀释至一定浓度后测定银耳多糖的含量。

1.2.2 银耳多糖含量的测定

多糖含量采用苯酚-硫酸法进行测定[18]。在490 nm波长下读取被测溶液的OD值。

1.2.3 银耳多糖抑菌试验

（1）菌悬液制备和使用。将白色念珠菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和乙型副伤寒沙门菌用0.5 mL已回温的菌株复溶水溶解后，用接种环分别取2环，将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌和铜绿假单胞菌接种至TSA培养基上，33 ℃培养24 h；将白色念珠菌接种至SDA培养基上，23 ℃培养3 d。上述菌株的新鲜培养物用0.9%无菌NaCl溶液制成菌悬液。用电子比浊仪检测上述菌悬液和孢子悬液浊度值，按0.5浊度值代表1.5×108 cfu·mL-1浓度计算，用0.9%无菌NaCl溶液对悬液进行梯度稀释至1.0×106 cfu·mL-1备用。上述悬液中菌株传代次数为2代（按从公司购买的冷冻干燥菌种为第1代计算），使用时将菌悬液加入培养基中制成含菌量为1.0×104 cfu·mL-1的带菌培养基。

（2）银耳多糖溶液制备。将提取的银耳多糖溶液，用无菌超纯水稀释为原液1/30浓度，经过0.22 µm过滤器过滤除菌后得到A1浓度银耳多糖溶液，再将A1浓度银耳多糖溶液按3倍法梯度稀释成A1的1/3、1/9、1/27、1/81浓度银耳多糖溶液。

（3）抑菌圈试验。在平皿中预先分别倒入约15 mL相应培养基，制成平板后，再加入5 mL相应带菌培养基，待培养基表面干后，呈三角形放入直径为6 mm的圆形滤纸片，立即加入20 µL银耳多糖溶液，每个浓度重复3次，静置30 min后放入33 ℃培养箱倒置培养（接有白色念珠菌的SDA平板需要放在23 ℃培养箱倒置培养）18 h后，开始观察抑菌效果，待观察到培养基表面长满菌落，按“十字交叉法”用游标卡尺测量抑菌圈直径。无菌超纯水作为空白对照。硫酸庆大霉素（40.00 µg·mL-1）对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和乙型副伤寒沙门菌具有较好的抑制效果，氟康唑（1.00 mg·mL-1）对白色念珠菌具有较好抑制效果，分别作为相应阳性对照。

2 结果与分析

2.1 银耳多糖溶液浓度

以溶液OD值（y）为纵坐标，以葡萄糖标准溶液质量浓度（x）为横坐标，绘制葡萄糖标准曲线。线性回归方程为y=0.066 169 4 x+0.006 083 03，r²=0.996 91，说明线性关系良好，说明该方法适合测定样品中的多糖含量，详见图1。通过回归方程测定1.2.3（2）中银耳多糖溶液A1浓度，测得A1浓度为151.42 µg·mL-1。

2.2 银耳多糖抑菌效果

观察银耳多糖对5种常见致病菌的抑菌效果，见表1。由表1可知，银耳多糖对铜绿假单胞菌、乙型副伤寒沙门菌、大肠埃希菌有抑制作用，对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌无明显抑制作用，其中1.87 µg·mL-1银耳多糖溶液对铜绿假单胞菌、乙型副伤寒沙门菌、大肠埃希菌都能产生抑菌效果，16.82 µg·mL-1银耳多糖溶液对乙型副伤寒沙门菌抑菌效果最好。

3 结论与讨论

在试验所研究的1.87～151.42 µg·mL-1的古田银耳多糖溶液中，1.87 µg·mL-1银耳多糖溶液对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌均有一定抑制作用，16.82 µg·mL-1银耳多糖溶液对乙型副伤寒沙门菌的抑制效果最好，而这一范围浓度的银耳多糖溶液对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌均无明显抑制作用，对于银耳多糖在抑菌活性的研究有一定参考价值，同时本试验仅对5种常见致病菌开展研究，银耳多糖对其他微生物的抑制作用有待研究。YIN等[19]研究发现植物多糖通过亲水和疏水作用、静电吸附或糖受体的存在与细菌相互作用。植物多糖的抗菌活性可以通过增加细胞膜的通透性、抑制病原菌对宿主细胞的吸附或阻断营养物质、能量物质的跨膜转运来发挥。本试验发现相对较低的银耳多糖（1.87 µg·mL-1）溶液反而可以产生一定的抑菌效果，可能与上述原因有关，值得探讨。

参考文献

[1]马传贵，张志秀，肖宝，等.银耳多糖的提取、生物活性及其应用概述[J].食用菌，2023，45（6）：4-6.

[2]XIA M，MENG Y，YAN H，et al.A review on the production，structure，bioactivities and applications of Tremella polysaccharides[J].International Journal of Immunopathology and Pharmacology，2021，35（3）：629-661.

[3]LIN W，FAN Z，BAODONG Z，et al.Stability and flavor of set yogurt fortified with Tremella fuciformis polysaccharide during cold storage[J].Current Research in Food Science，2023，7：100536.

[4]俞锦阳，陈祎凝，詹圣.我市“古田银耳”品牌价值达89.91亿元[N].闽东日报，2023-03-24（1）.

[5]曾秋玲.古田食用菌产业发展途径初探[J].广东蚕业，2020，54（12）：129-130.

[6]谢丹莹，谢景昊，黄若超，等.铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定和全基因组序列分析[J].中国兽医杂志，2023，59（12）：1-10.

[7]MADUAKOR U，ELEAZAR C，NWAFOR C，et al.Antibiogram of Pseudomonas aeruginosa clinical isolatestested for pan， extensive and multidrug resistances[J].Microbiology Research Journal Internation-al，2023，33（11/12）：14-21.