花生肽亚铁离子螯合物的制备工艺研究
作者: 慈傲特 王彪 何玮
摘 要:本研究以花生蛋白为原料,与FeCl2·4H2O反应制备花生肽亚铁螯合物,主要考察指标为亚铁离子螯合率,辅助考察指标为花生肽亚铁螯合物得率,在单因素实验基础上采用Box-Behnken响应面分析,考察pH值、温度、时间、肽铁质量比对螯合率的影响,从而得到花生肽亚铁离子螯合物的最佳制备工艺。结果表明,当pH值为7.0、螯合温度为35 ℃、螯合时间为30 min、肽铁质量比为4∶1时,螯合率最高,为65.09%。
关键词:花生肽;亚铁离子;螯合物;螯合率
Study on the Preparation Process of Peanut Peptide Ferrous Ion Chelate
CI Aote, WANG Biao, HE Wei
(Department of Pharmacy, Anqing Medical and Pharmaceutical College, Anqing 246052, China)
Abstract: In this study, peanut peptide ferrous chelates were prepared by reacting peanut protein with FeCl2·4H2O, the main index was the ferrous ion chelating rate, and the auxiliary index was the yield of peanut peptide ferrous chelates. On the basis of the one-way experiments, Box-Behnken response surface analysis was used to investigate the effects of pH, temperature, time, and peptide-iron mass ratio on the chelating rate so as to screen the optimal process for the preparation of peanut peptide ferrous chelates. The optimal process for the preparation of ferrous ion chelates was selected. The results showed that when the pH value was 7.0, the chelating temperature was 35 ℃, the chelating time was 30 min, and the mass ratio of peptide to iron was 4∶1, the chelating rate was the highest, which was 65.09%.
Keywords: peanut peptide; ferrous ions; chelate; chelation rate
铁是构成人体组织和维持身体健康的必需微量元素,除了构成血红素参与氧气运输外,铁还是参与细胞代谢大部分酶的组成成分,还有助于维持正常的造血功能及增强免疫功能[1-2]。缺铁性贫血作为营养缺乏症之一,在我国较为常见,主要是由于铁在人体中需要经过转运载体跨膜转运进入肠上皮细胞后才可以进行吸收[3]。传统无机补铁剂有刺激胃肠道或缺乏转运载体导致吸收较为缓慢的缺点,从而限制了其应用[4]。多肽本身可以作为铁离子吸收的载体进行跨膜运输,且消耗能量低、吸收快。因此亚铁离子-肽螯合物有望成为新型补铁剂,该补充剂具有溶解度好、吸收利用率高、无毒副作用等优点,其可在胃肠道中缓慢释放,有利于在体内的吸收利用[5]。目前有研究者利用复合蛋白酶将小米糠蛋白酶解后制备小米糠多肽亚铁螯合物,体外模拟胃肠道消化结果表明,多肽-亚铁螯合物比FeSO4、乳酸亚铁的稳定性更高[6]。楼钰航[7]利用延边黄牛骨为原料制备了清蛋白多肽螯合铁和球蛋白多肽螯合铁。缪佳瑜[8]将鱿鱼蛋白肽螯合铁进行微胶囊化,研究表明亚铁螯合肽微胶囊化后能够展示出较好的受控释放性能。
我国拥有丰富的花生资源,花生粕作为花生油的副产物常常被丢弃,从而造成资源浪费[9]。由于花生粕含有大量的优质蛋白质,以花生粕蛋白为原料制备金属离子螯合肽可以大大提高矿物质在人体内的吸收利用率。本研究采用碱性蛋白酶制备花生肽,与FeCl2·4H2O反应制备花生肽亚铁螯合物。通过单因素实验和响应面实验,筛选出制备花生肽亚铁螯合物的最优工艺条件,为新型补铁原料的研发、生产和利用提供一定的参考依据。
1 材料与方法
1.1 实验仪器
SHIMADZU电子分析天平,日本岛津仪器有限公司;LG-10C冷冻干燥机,四环福瑞科仪科技发展有限公司;JK-500B型超声波清洗器,南北科仪(北京)科技有限公司;UV-2600紫外可见分光光度计,日本岛津仪器有限公司。
1.2 实验试剂
碱性蛋白酶、氯化亚铁(AR级)、邻菲罗啉(AR级)、无水乙酸钠(AR级)、硫酸亚铁铵(AR级),上海源叶生物科技有限公司;氢氧化钠(AR级)、盐酸羟胺(AR级)、无水乙醇(AR级),西陇科学股份有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 花生肽的制备
花生肽的制备流程为花生粕蛋白溶液→预处理(90 ℃,10 min水浴)→酶解(调节pH值,加入蛋白酶)→终止反应(100 ℃水浴10 min)→离心(取上清液,冷冻干燥)→花生肽。
1.3.2 花生肽亚铁螯合物的制备
(1)根据熊喆等[10]的方法制备花生肽亚铁螯合物。称取一定量的花生肽冻干粉于锥形瓶中,加入去离子水控制料液比,再加入一定量抗坏血酸混匀,调节pH值,根据不同质量比加入氯化亚铁,在设定的温度下水浴加热一定时间,然后加入6倍体积的无水乙醇,在室温下静置,离心,舍弃上清液,用无水乙醇洗涤沉淀后再次离心,多次洗涤,收集沉淀,冻干,用研钵研磨冻干产物得到粉末,于-20 ℃冷冻保存。
(2)花生肽亚铁螯合物制备工艺单因素实验。分别以pH值、温度、时间和肽铁质量比为考察因素,设计单因素实验,实验条件见表1。
(3)花生肽亚铁螯合物制备工艺响应面实验。在单因素实验的基础上,将花生肽亚铁螯合反应的螯合率作为响应值,利用minitab软件设计中的Box-Benhnken设计响应面实验,因素水平见表2,确定最佳工艺条件。
1.3.3 亚铁离子含量测定
(1)标准曲线测定。采用邻菲啰啉比色法[11]。准确称取一定量硫酸亚铁铵,配制成浓度为10 μg·mL-1的铁离子标准溶液。分别取不同体积的的铁离子标准液于50 mL容量瓶中,依次加入2 mL 5%的抗坏血酸溶液和5 mL浓度为0.1%的邻菲啰啉,定容至刻度线,配制成浓度分别为0 μg·mL-1、0.4 μg·mL-1、0.8 μg·mL-1、1.2 μg·mL-1、1.6 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1的系列标准工作溶液。将系列标准工作溶液于37℃下恒温放置10 min,测定510 nm处的吸光度。
(2)样品测定。准确称取一定量肽铁螯合物→加水溶解→定容至100 mL→吸取样品溶液→测定样品中铁含量→3次试验→取平均值[12]。螯合率按公式(1)计算,螯合物得率按公式(2)计算。
式中:m1为螯合物中铁的量,mg;m2为加入反应体系中铁的总量,mg。
式中:W1为螯合物的总质量,mg;W2为花生肽和铁盐的总质量,mg。
2 结果与分析
2.1 亚铁离子含量测定结果
以亚铁离子浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线(图1),得到线性方程y=0.157 4x+0.014 5,R2=0.991 7。结果表明,该标准曲线线性关系良好,可以依据吸光度计算亚铁离子含量。
2.2 花生肽亚铁螯合物制备工艺单因素实验结果
2.2.1 反应pH值对螯合效果的影响
如图2所示,随着pH值上升,花生肽亚铁螯合物的螯合率先升高再降低,在pH值为7时螯合率最高,为58.83%,此时螯合物得率为50.62%。研究发现,pH值较小时溶液呈酸性,供电子基团H+会与Fe2+争夺电子基团;而pH值较高时,过多的OH−易与Fe2+产生沉淀,影响螯合效果[13-14]。因此,中性环境中螯合率最高。当多肽pH值接近等电点时,其螯合效果受供电子基团和吸电子基团干扰较小,此时多肽可以充分与金属离子通过配位键形成螯合物。这与汪婧瑜等[15]制备乌鳢短肽螯合铁的研究结果一致。
2.2.2 反应温度对螯合效果的影响
温度升高不仅可以提高反应速率,也会影响螯合效果。如图3所示,随着温度的升高,螯合率先上升再降低,在35 ℃达到最大,为62.49%,此时螯合物得率为49.29%。肽在水中的溶解度会随着温度的升高而增大,螯合反应速率随着Fe2+与多肽的侧链接触点增多而提高,从而提高花生肽亚铁离子螯合物的螯合率[16]。但温度继续升高,会使多肽之间发生副反应,氨基酸或小肽发生羰氨反应等现象,副反应产物会与Fe2+形成竞争关系,且螯合物在高温条件下稳定性较差,极易分解,影响螯合效果,导致螯合率和螯合物得率下降[17-18]。
2.2.3 反应时间对螯合效果的影响
如图4所示,15~30 min螯合率逐渐上升达到62.51%,随后螯合率稍有下降。在一定条件下,螯合时间越短,螯合反应越不充分,有大量游离铁和花生肽未参与反应;当螯合时间超过一定时长时,螯合反应会随着螯合时间的延长持续发生解离作用,且可能产生一定量的副产物,导致螯合率降低,螯合效果差[19-20]。研究表明,螯合反应达到一定程度时,反应时间对螯合物的影响较低[21]。
2.2.4 多肽与亚铁盐质量比对螯合效果的影响
花生肽亚铁螯合物的制备是以氯化亚铁和花生肽为底物进行螯合反应,因此螯合效果也会受到反应底物相对含量的影响。如图5所示,实验选用了5组不同的多肽与亚铁盐质量比进行实验,随着多肽与亚铁盐质量比的增加,螯合率先上升后降低,在3∶1时螯合率最高为60.61%,此时螯合物得率为50.97%,随后逐渐平稳。主要原因是反应底物浓度较低时,过量的Fe2+无法全部参与反应,随着花生肽含量的增加,螯合率和螯合物得率逐渐增高,当达到一定比例后,略有降低,主要是由于亚铁离子数量有限,部分多肽未参与反应[22-24]。
2.3 花生肽亚铁螯合物制备工艺响应面实验结果
2.3.1 响应面实验设计及结果
根据上述单因素实验研究的结果,利用Minitab软件中的Box-Behnken设计pH值、温度、时间和肽铁质量比4因素3水平响应面实验,探究螯合效果受到不同影响因素的交互影响,所得结果如表3所示。利用Minitab软件对表3的试验结果进行拟合分析,得到螯合率(Y)的二次响应面回归模型为
Y=-544.7+154.25A+2.461B+0.355C+7.65D-11.011A2-0.047 84B2-0.017 10C2+0.081 5AB+0.060 7AC-0.905AD+0.009 12BC
2.3.2 响应面结果分析
由回归方程方差分析表(表4)可知,此响应面的模型P值<0.000 1极显著,模型成立;失拟项中P值>0.05,不显著,模型未失拟;模型的回归系数R2为0.929 1,调整后R2为0.965 7,说明该回归方程有96.57%的可能性可以解释各因素与螯合率的变化情况。其中A、C、D和二次项A2、B2、C2对螯合率的影响极为显著(P<0.01),二次项BC对螯合率影响显著(P<0.05)。pH值、螯合时间和肽铁质量比对螯合率有极显著影响,比较F值可知,pH值对螯合实验的影响最大,肽铁质量比和螯合时间次之,螯合温度影响最小。