液相色谱法测定酱油中栀子黄的含量
作者: 黄锦波
作者简介:黄锦波(1988—),男,广东信宜人,本科,助理工程师。研究方向:食品、化妆品与药品领域的理化分析与功效。
摘 要:目的:建立液相色谱法测定酱油中栀子黄含量的方法。方法:以栀子黄的表征成分(藏花素与藏花酸)为目标物,以Hypersil BDS C18柱为分离柱,以甲醇与1%乙酸水为流动相,梯度洗脱,检测波长为435 nm,外标法定量。结果:藏花素与藏花酸的色谱峰峰形良好,在各自的线性范围内线性关系良好,相关系数(R2)均大于0.999;回收率在90.52%~103.03%,相对标准偏差在0.5%~4.5%,方法检出限分别为
2.13 mg·kg-1、5.57 mg·kg-1。结论:该方法前处理过程较为简单,结果重现性好、灵敏度高,回收率符合要求,适用于酱油中栀子黄含量的测定。
关键词:液相色谱法;酱油;栀子黄;藏花素;藏花酸
Determination of Gardenia Yellow in Soy Sauce by
Liquid Chromatography
HUANG Jinbo
(Guangzhou Golden Assessment Testing Institute Co., Ltd., Guangzhou 510000, China)
Abstract: Objective: To establish a liquid chromatography method for the determination of gardenia yellow content in soy sauce. Method: The characterization components of gardenia yellow (crocin and crocetin) were used as the target substances, Hypersil BDS C18 column was used as the separation column, methanol and 1% acetic acid water were used as mobile phases, the detection wavelength was 435 nm, and the quantification method was externally standardized. Result: The chromatographic peaks of crocin and crocetin were well shaped, and the linear relationship (R2) was more than 0.999, the recovery rate was 90.52% to 103.03%, the relative standard deviation was 0.5% to 4.5%, and the detection limits of the method were 2.13 mg·kg-1 and 5.57 mg·kg-1, respectively. Conclusion: The pretreatment process of this method is relatively simple, the results are reproducible, the sensitivity is high, and the recovery rate meets the requirements, which is suitable for the determination of gardenia yellow content in soy sauce.
Keywords: liquid chromatography; soy sauce; gardenia yellow; crocin; crocetin
酱油是以黄豆为原料,经发酵等工艺制作而成,是我国历史悠久的传统美食[1]。酱油制作过程中,往往会添加一定量的栀子黄,起到增色的作用。根据《食品安全标准 食品添加剂》(GB 2760—2014)的规定,栀子黄在酱油中的最大使用限量为1.5 g·kg-1,但长期食用栀子黄超标的酱油会对人体的肝脏和肾脏等造成危害[2],因此需要对酱油中栀子黄含量进行检测。
栀子黄的主要表征成分为藏花素与藏花酸。根据《食品安全国家标准 食品中栀子黄的测定》
(GB 5009.149—2016),当酱油称样量为1.0 g时,藏花素的方法检出限为50 mg·kg-1,藏花酸的方法检出限为10.0 mg·kg-1,检出限较高。本研究优化检测方法,旨在降低方法的检出限,为酱油中栀子黄的监测提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
藏花素(编号:SHAM-98138;标准值:98.5%)、
藏花酸(编号:SHAM-131602;标准值:99.5%),均购自北方伟业计量集团有限公司;甲醇:色谱纯,上海麦克林试剂官网有限公司;亚铁氰化钾
(106 g·L-1)、乙酸铅(220 g·L-1),分析纯,广州化学试剂厂有限公司;酱油(海天味道极鲜特级酱油,批次:20240531),广东海天集团股份有限公司。
1.2 仪器与设备
安捷伦1260液相色谱仪;万分之一电子天平(感量为0.1 mg)。
1.3 试验方法
1.3.1 色谱条件
二极管阵列检测器;赛默飞Hypersil BDS C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱箱温度:35 ℃;流速:1 mL·min-1;检测波长:435 nm;流动相:甲醇-乙酸水溶液,梯度洗脱,洗脱程序见表1。
1.3.2 溶液配制
(1)藏花素与藏花酸混合标准溶液配制。分别称取标准品0.01 g于同100 mL棕色容量瓶中,加甲醇稀释成浓度为100 μg·mL-1的混合标准溶液。
(2)混合标准系列工作液配制。分别准确量取一定量的上述混合标准溶液于10 mL棕色容量瓶中,用甲醇稀释并定容,配制成0.11 μg·mL-1、0.21 μg·mL-1、0.43 μg·mL-1、0.85 μg·mL-1和1.06 μg·mL-1的藏花素标准系列工作液,以及0.11 μg·mL-1、0.22 μg·mL-1、0.45 μg·mL-1、0.89 μg·mL-1和1.11 μg·mL-1的藏花酸标准系列工作液。
1.3.3 样品前处理
准确称取酱油样品2 g于10 mL比色管中,分别加入2 mL亚铁氰化钾(106 g·L-1)与乙酸铅
(220 g·L-1),用一级水定容,离心取上清液1 mL于10 mL比色管中,甲醇溶解并定容,有机滤膜过滤,上机待测。
1.3.4 目标物含量计算
样品中目标物含量计算公式为
(1)
式中:W为样品中目标物含量,mg·kg-1;c为通过工作曲线计算得到的浓度,μg·mL-1;v为样品首次定容体积,mL;m为样品质量,g。
2 结果与分析
2.1 提取溶剂的选择
藏花素与藏花酸为脂溶性物质,因此试验考察甲醇、乙腈、异丙醇及正己烷作为提取溶剂时的提取效果。结果发现,藏花酸在正己烷中的溶解情况不理想,而甲醇、乙腈、异丙醇均能溶解这两种目标物,考虑到这3种溶剂中甲醇价格最为便宜,因此试验选择甲醇作为提取剂。
根据相关文献可知,酱油中含有蛋白质与氨基酸[3],因此本试验加入2 mL蛋白质沉淀剂(106 g·L-1亚铁氰化钾与220 g·L-1乙酸铅)进行净化,以期在提取前尽量除去干扰物质。
2.2 检测波长的选择
分别取1 mL藏花素与藏花酸的混合标准溶液进行全波长扫描,结果发现藏花素吸收波长在430~460 nm,445 nm处响应值最高;藏花酸的吸收波长在410~450 nm,435 nm处响应值最高。为了方便计算与查看色谱图,同时满足藏花酸的灵敏度要求,本试验选择的检测波长为435 nm。
2.3 色谱柱的选择
考察了Hypersil BDS C18色谱柱、Hypersil APS-2
色谱柱、Hypersil GOLD C8色谱柱(规格均为3 0 m×
0.25 mm,0.25 μm)对分离效果的影响。结果发现,使用Hypersil APS-2色谱柱分离目标物时,目标物无响应;使用Hypersil BDS C18和Hypersil GOLD C8色谱柱测试时,2种目标物均有响应,但Hypersil BDS C18的响应更高,分离度更好。因此,本试验选用Hypersil BDS C18色谱柱作为分离柱。
2.4 方法学验证结果
2.4.1 目标物检测
取适量混合标准品溶液与加标样品溶液,按1.3.1项色谱条件测定,结果见图1。分析可知,该分析方法能有效分离目标物与干扰物质,且峰形良好。
2.4.2 线性关系
按1.3.1项色谱条件,对藏花素与藏花酸混合标准系列工作液进行测定,以峰面积(A)为纵坐标,以系列标准溶液浓度(C)为横坐标,绘制标准曲线[4],所得线性方程即相关系数见表2。分析可知,两种目标物质在各自的线性范围内线性关系良好,相关系数(R2)均大于0.999。
表2 线性方程及相关系数
项目名称 线性方程 相关系数(R2)
藏花素 A=1.432 9C-0.239 1 0.999 7
藏花酸 A=1.302 1C-0.132 9 0.999 8
2.4.3 灵敏度试验
称取2 g(准确至0.01 g)样品,准确加入0.1 mL
浓度约为100 μg·mL-1的混合标准溶液,按1.3.3项样品前处理方法进行处理后,逐级稀释上机测试。以信噪比≥3确定藏花素和藏花酸的检出限[5]。结果表明,藏花素和藏花酸的方法检出限分别为
2.13 mg·kg-1、5.57 mg·kg-1,比GB 2760—2014中规定的方法检出限更为理想。
2.4.4 重现性试验
取浓度约为1.0 μg·mL-1的混合标准品溶液
1 μL,平行测定6次,计算目标物峰面积的相对标准偏差,结果见表3。藏花素与藏花酸的峰面积的相对标准偏差分别为0.06%、0.12%,说明试验重现性较好,无明显偏差。
2.4.5 加标回收率试验
精确称取不含有目标物的样品约2 g,共3份,分别加入0.01 mL、0.02 mL、0.10 mL浓度约为
100 μg·mL-1的混合标准溶液,按1.3.3项样品前处理方法处理后,按1.3.1项色谱条件测试,计算藏花素与藏花酸的回收率,结果见表4。可以看出,目标物回收率在90.52%~103.03%,相对标准偏差在0.5%~4.5%,说明该方法检测结果准确、可靠。
3 结论
本试验建立了液相色谱法测定酱油中栀子黄含量的方法,该方法能很好地分离栀子黄的表征成分(藏花素与藏花酸),藏花素与藏花酸的加标回收率在90.52%~103.03%,相对标准偏差在0.5%~4.5%,藏花素、藏花酸对应的方法检出限分别为2.13 mg·kg-1与5.57 mg·kg-1。这说明本方法稳定性好、检测灵敏度高,适合酱油中栀子黄含量的测定。
参考文献
[1]张智宏,陈嘉琳,黄鑫,等.酱油的历史及原酿造酱油发展趋势[J].现代食品科技,2023,39(12):302-309.
[2]魏洪鑫,李思成,宁钧宇,等.天然色素栀子黄的危害评估研究[J].中国食品卫生杂志,2021,33(4):
468-474.
[3]杨春晖,王文平,续丹丹,等.不同原料酿造酱油功能成分及抗氧化活性比较[J].食品工业科技,2023,44
(14):318-325.
[4]刘纲勇,黄锦波.高效液相色谱法测定茶枯粉中3种激素[J].化学分析计量.2022,31(5):18-22.
[5]刘纲勇,黄锦波.气相色谱法测定橄榄油中22种有机氯农药[J].理化检验(化学分册).2020,56(5):606-611.