凝胶色谱净化-气相色谱法测定坚果中BHA、BHT和TBHQ的含量

摘 要：目的：建立凝胶色谱净化-气相色谱法测定坚果中叔丁基对羟基茴香醚（Butylated Hydroxyanisole，BHA）、2，6-二叔丁基对甲基苯酚（Butylated Hydroxytoluene，BHT）、特丁基对苯二酚（Tertiary Butylhydroquinone，TBHQ）含量的分析方法。方法：坚果样品用石油醚提取，经凝胶色谱系统净化，旋转蒸发浓缩后，用气相色谱外标法定量检测。结果：3种抗氧化剂在0.01～0.10 mg·mL-1线性关系良好，方法检出限与定量限分别为0.002 g·kg-1和0.005 g·kg-1，加标回收率在89.15%～104.40%，精密度在1.85%～4.87%。结论：该方法准确可靠，适用于食品检验检测机构对坚果中3种抗氧化剂的检测。

关键词：抗氧化剂；坚果；凝胶色谱净化-气相色谱法

Abstract： Objective： The method for the determination of butylated hydroxyanisole （BHA）， butylated hydroxytoluene （BHT） and tertiary butylhydroquinone （TBHQ） in nuts by gel chromatography purification-gas chromatography was established. Method： The nut sample was extracted with petroleum ether， purified by gel chromatography system， concentrated by rotary evaporation， and determined by external standard method of gas chromatography. Result： The three antioxidants showed a good linear relationship within the range of 0.01～0.10 mg·mL-1， with detection and quantification limits of 0.002 g·kg-1 and 0.005 g·kg-1 respectively. The recovery rate ranged from 89.15%～104.40%， and the precision ranged from 1.85%～4.87%. Conclusion： This method is accurate and reliable， and is suitable for food inspection and testing institutions to detect three types of antioxidants in nuts.

Keywords： antioxidant; nuts; gel chromatography purification-gas chromatography

坚果营养丰富，富含蛋白质、矿物质、维生素等有益成分，有增强体质、明目健脑、预防疾病等功效。然而，坚果炒货食品中油脂含量较高，在加工储运等过程中较易出现油脂氧化酸败，导致食品出现异味，并对食用者的身体健康产生威胁，所以坚果炒货加工过程中通常会加入抗氧化剂来抑制油脂的氧化[1]。叔丁基对羟基茴香醚（Butylated Hydroxyanisole，BHA）、2，6-二叔丁基对甲基苯酚（Butylated Hydroxytoluene，BHT）、特丁基对苯二酚（Tertiary Butylhydroquinone，TBHQ）是3种常用的人工合成抗氧化剂，在食用油、坚果炒货等加工中运用较广泛，有效延长了产品的货架期与保质期，但过量使用抗氧化剂，人体摄入后会产生DNA损伤、致癌等，因此加强坚果炒货食品中BHA、BHT、TBHQ等抗氧化剂的检测非常必要[2]。本研究参照《食品安全国家标准 食品中9种抗氧化剂的测定》（GB 5009.32—2016）[3]中第四法气相色谱法，结合实验室条件设备，建立了凝胶色谱净化-气相色谱法测定坚果中BHA、BHT和TBHQ含量的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

BHA标准品（纯度99.51%），德国DrEhrenstorfer公司；BHT标准品（纯度99.9%）、TBHQ标准品（纯度99.7%），均购于北京TMstandard公司；乙腈、正己烷、石油醚（沸程30～60 ℃），均为色谱纯，购于美国Thermo fisher公司；实验室用水为一级超纯水。

1.2 仪器与设备

7890A气相色谱仪（配FID检测器），美国安捷伦公司；Preplinc全自动凝胶净化系统，美国J2 Scientific公司；ME3002E电子天平（精度0.01 g）、AL104分析天平（精度0.1 mg），瑞士梅特勒托利多公司；VORTEX MS3旋涡混合仪，德国艾卡公司；P/N Hei-VAP Precision ML/G3旋转蒸发仪，德国海道夫公司；Synergy超纯水机，德国密理博公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液配制

（1）混合标准储备溶液。准确称取BHA、BHT、TBHQ标准品各0.005 0 mg于烧杯中，用乙酸乙酯和环己烷混合溶液（1+1，V/V）全部转移至50 mL棕色容量瓶中，定容，摇匀，配制成BHA、BHT、TBHQ浓度均为1.0 mg·mL-1的混合储备液，于4 ℃冰箱避光保存。

（2）混合标准工作系列。分别吸取BHA、BHT、TBHQ混合储备液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL于6个10 mL的容量瓶中，用乙酸乙酯和环己烷混合溶液（1+1，V/V）稀释并定容，配制成浓度分别为0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1和0.10 mg·mL-1的BHA、BHT、TBHQ混合标准工作系列。

1.3.2 试样处理过程

称取5.00 g（精确至0.01 g）粉碎混匀的坚果试样，置于250 mL具塞三角瓶中，加入石油醚至完全浸没试样，静置过夜，经快速滤纸过滤，滤液收集于旋蒸瓶中，旋转蒸发得到油脂。

准确称取0.500 0 g（精确至0.000 1 g）旋转蒸发得到的油脂，用乙酸乙酯和环己烷混合溶液（1+1，V/V）稀释，全部转移入10 mL容量瓶中，定容，涡旋混匀后，待净化。

将上述待净化液过0.45 μm有机滤膜，转移至凝胶色谱专用样品瓶中，置于全自动凝胶净化色谱仪上，经过凝胶色谱装置净化，收集流出液，旋转蒸发至近干，用乙酸乙酯和环己烷混合溶液（1+1，V/V）复溶，定容至1.0 mL，供气相色谱仪测试。

1.4 仪器测定条件

1.4.1 凝胶净化条件

凝胶色谱柱：CO115快速净化柱；流动相：乙酸乙酯+环己烷（1+1，V/V）；流速：5 mL·min-1；进样量：5 mL；流出液收集时间：15.50～25.50 min；紫外检测器波长：254 nm。

1.4.2 气相色谱条件

色谱柱：DB-1701毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气：高纯氮；柱流速：1.0 mL·min-1；进样口温度：230 ℃；进样方式：不分流进样；柱箱温度：80 ℃保持1 min，以10 ℃·min-1升温至230 ℃保持10 min；FID检测器温度：250 ℃；氢气流量：30 mL·min-1；空气流量：400 mL·min-1；尾吹氮气流量：30 mL·min-1。

2 结果与分析

2.1 色谱分离分析

将配制的BHA、BHT、TBHQ浓度为0.1 mg·mL-1的混合标准工作溶液在1.4.2气相色谱条件下上机测试，26 min内可以完成3种抗氧化剂的在线分析，色谱图如图1所示。3种抗氧化剂组分的色谱峰尖锐对称，完全分离。进一步对试剂空白、阴性坚果及加标样品进行测试，虽然坚果样品中杂质较多，但是经过净化处理后试样中杂质峰、溶剂峰等并未对3种抗氧化剂组分产生干扰，可以进行准确的定性定量分析。

2.2 线性关系、检出限与定量限

将配制的BHA、BHT、TBHQ混合标准工作系列在1.4.2气相色谱条件下上机测试，以3种抗氧化剂组分的浓度为横坐标，相对应测得的色谱峰面积为纵坐标，采用仪器配置的ChemStation工作站自动绘制标准工作曲线，计算线性回归方程与相关系数。根据3倍信噪比（3S/N）对应的目标组分含量计算方法检出限，10倍信噪比（10S/N）对应的目标组分含量计算方法定量限，结果见表1。

由表1中数据可知，3种抗氧化剂组分在0.01～0.10 mg·mL-1线性关系良好，相关系数r均大于0.999，满足《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》（GB/T 27417—2017）[4]中对标准曲线线性的要求。方法检出限均为0.002 g·kg-1，定量限均为0.005 g·kg-1，满足GB 5009.32—2016中对定性与定量方法的要求。

2.3 方法的加标回收率与精密度

在3种代表性的阴性坚果样品（核桃、瓜子、蚕豆）中，根据3种抗氧化剂的方法定量限和《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[5]中的最大使用量（以油脂中的含量计），添加低（1倍定量限0.005 g·kg-1）、中（2倍定量限0.010 g·kg-1）、高（最大使用量0.200 g·kg-1）3种浓度水平的混合标准溶液，按照1.3.2试样处理过程与1.4仪器测定条件对每个浓度水平平行测定6次，计算加标回收率与精密度。由表2中数据可知，3种坚果样品中BHA的回收率为91.23%～103.50%，精密度RSD为1.85%～4.41%；BHT的回收率为93.17%～103.90%，精密度RSD为2.35%～4.87%；TBHQ的回收率为89.15%～104.40%，精密度RSD为2.12%～4.55%，加标回收率与精密度均符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）[6]中的规定。

3 结论

本研究建立了凝胶色谱净化-气相色谱法测定坚果中BHA、BHT和TBHQ含量的分析方法。实验结果表明，坚果中3种抗氧化剂经石油醚提取、凝胶色谱系统净化、气相色谱检测，方法的线性关系良好，检出限与定量限较低，加标回收率及精密度均符合相关标准的规定，可以满足食品检验检测实验室对坚果样品中BHA、BHT和TBHQ的高通量检测需求。

参考文献

[1]谢玉鹏.不同抗氧化剂在坚果炒货食品中应用研究[J].现代食品，2019（1）：151-153.

[2]廖梦莎，刘香香.气相色谱-质谱法同时测定坚果中的4种抗氧化剂[J].四川农业科技，2020（8）：56-58.

[3]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中9种抗氧化剂的测定：GB 5009.32—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[4]国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.合格评定 化学分析方法确认和验证指南：GB/T 27417—2017[S].北京：中国标准出版社，2017.

[5]国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品添加剂使用标准：GB 2760—2014[S].北京：中国标准出版社，2014.

[6]国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.实验室质量控制规范 食品理化检测：GB/T 27404—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.