农村饮用水菌落总数的测量不确定度评定

摘 要：目的：对农村饮用水菌落总数进行测量不确定度评定。方法：采集农村饮用水，采用平板计数法对水样菌落总数进行检测和计数，按照国家计量技术规范相关方法，分析菌落总数的不确定度来源，并评定菌落总数的测量不确定度。结果：重复测定和培养基配制引入的不确定度贡献较大，其次是样品吸取和稀释体积引入的不确定度；计算得出扩展不确定结果为0.015 4，基于该不确定度值计算农村城郊和山区4种水源水（溪水、地下水、水库水和河水）的菌落总数，获得检测结果为170～380 CFU·mL-1，均低于500 CFU·mL-1，符合《生活饮用水卫生标准》（GB 5749—2022）要求。

关键词：农村饮用水；菌落总数；不确定度评定

Abstract： Objective： To evaluate the uncertainty of the total number of bacterial colonies in rural drinking water sources. Method： Rural drinking water was collected， and the total number of colonies in water samples was detected and counted by plate counting method. According to the relevant methods of the national technical specification for measurement， the sources of uncertainty of the total number of colonies were analyzed， and the measurement uncertainty of the total number of colonies was evaluated. Result： The uncertainty introduced by repeat assay and medium preparation contributed the most， followed by the uncertainty introduced by sample uptake and dilution volume. The calculated extended uncertainty result was 0.015 4. Based on this uncertainty value， the total number of colonies in four source waters （streams， groundwater， reservoir water and river water） in rural suburbs and mountain areas was calculated， the detected results were 170～380 CFU·mL-1， all of which are lower than 500 CFU·mL-1， meeting the requirements of GB 5749—2022.

Keywords： rural drinking water; total number of colonies; uncertainty assessment

水是生命的源泉，是人们生存和发展的物质基础。水体中微生物指标超标易引发传染性肠道疾病[1]。近年来，微生物污染生活饮用水所致的突发公共卫生事件时有发生，引起社会各界的高度关注。很多国家的饮用水卫生标准中，将微生物指标放在第一位进行监测[2]。大部分山区农村饮用水仍以溪水、水库水、河水、地下水为主，其微生物超标现象较为常见[3]。因此，加强农村饮用水微生物检测至关重要。测量不确定度可为评定检测结果的可信度、质量提供有效的手段。鉴于此，在农村饮用水微生物检测过程中，有必要对其进行测量不确定度评定。

1 材料与方法

1.1 样本来源

于2023年4月分别在湖南省邵阳市新邵县城郊（新田铺镇）和山区（迎光乡）采集溪水、地下水、河水、水库水等4种水源水。按照《生活饮用水标准检验方法 第2部分：水样的采集与保存》（GB/T 5750.2—2023）进行样品采集，每种水源水采集混合样品后分装成2份，共8份水样。

1.2 仪器与试剂

生化培养箱（DHP-9162），北京市永光明医疗仪器有限公司；立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-50SII），上海博迅实业有限公司医疗设备厂；双人单面垂直送风净化工作台（SW-CJ-2D），苏州博莱尔净化设备有限公司；电子天平（Scout SE-SE202F），奥豪斯仪器（常州）有限公司。

蒸馏水、无菌生理盐水、乳糖蛋白胨培养液，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.3 检测方法

菌落总数因与水体有机物污染密切相关，成为评价水质微生物污染的重要指标之一，因此本研究重点检测农村饮用水中的菌落总数。8份水样均分别进行2次重复测定，选择其中1份水样进行同一检测人员的10次重复测定，用于不确定度的重复测定分析。所有水样中菌落总数严格按照《生活饮用水标准检验方法 第12部分：微生物指标》（GB/T 5750.12—2023）的要求进行检测，具体检测步骤如下。

（1）无菌耗材准备。按照GB/T 5750.12—2023中营养琼脂培养基配制方法称量各试剂，用蒸馏水稀释溶解后调节pH值为7.4～7.6后，置于高压灭菌锅内高压灭菌；将若干支准备好的1 mL和10 mL试管、移液管、移液枪头及适量生理盐水置于高压灭菌锅内高压灭菌，设置参数为121 ℃、30 min。

（2）样品稀释。用10 mL试管移取9 mL无菌生理盐水注入准备好的试管，以无菌操作方法用移液器吸取1 mL充分混匀的农村饮用水水样注入上述试管中，混匀成1∶10（体积比）稀释液。再用移液器吸取1∶10（体积比）的稀释液1 mL注入另一个9 mL无菌生理盐水试管中，混匀成1∶100（体积比）稀释液。按上述方法继续稀释成1∶1 000（体积比）稀释液体备用。

（3）样品接种。以无菌操作方法用移液器吸取上述3个浓度的稀释液水样1 mL，分别注入无菌平皿内，再注入约15 mL已融化并冷却到45 ℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀，每个梯度水样均做一组平行接种，并做空白对照实验。

（4）样品培养。待平皿内培养基冷却凝固后，将其翻转使底面向上，置于37 ℃生化培养箱内培养（48±2）h。

（5）菌落计数与结果报告。培养结束后选择平均菌落数在30～300 CFU·mL-1的菌落进行计数，按照GB/T 5750.12—2023稀释度选择及菌落总数报告方式表格中的方法进行报告。

1.4 数学模型建立

农村饮用水中菌落总数的计算公式为

式中：A为样品中菌落总数，CFU·mL-1；N为平皿内菌落总数，CFU·mL-1；fn为该平皿样品的稀释倍数。

1.5 农村饮用水中菌落总数判断依据

根据扩展不确定度值获得8份水样的菌落总数检测结果，依据《生活饮用水卫生标准》（GB 5749—2022）中小型集中式供水和分散式供水水源水要求进行判断，其菌落总数限值为500 CFU·mL-1。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源分析

按照《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012），对检测过程中各类不确定来源进行综合分析。本文重点对水样菌落总数检测过程中样品稀释体积、样品吸取体积、培养基配制、培养条件和重复测定结果等不确定度分量进行分析评定。

2.2 不确定分量评定

2.2.1 样品稀释体积引入的相对标准不确定度urel（V1）

样品稀释体积引入的不确定度属于B类不确定度。本文以无菌操作吸取每份样品1 mL，用9 mL无菌生理盐水进行稀释，混匀后即得10-1稀释液，再依次逐级稀释为10-2和10-3稀释液，因此需要用到1 mL移液管3次、10 mL移液管3次，由此引入的相对标准不确定度分析如下。

（1）移液管容量允差引起的不确定度。根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）中计量检定容量允差d分别为0.007 mL（单标）和0.05 mL（分度），按矩形分布，k=，则1 mL和10 mL移液管容量允差引起的标准不确定度分别为

（2）移液管随机变化引起的不确定度。用移液管连续10次吸取刻度用超纯水，用万分之一天平称量后按贝塞尔公式计算出1 mL和10 mL移液管随机变化引起的标准不确定度分别为

（3）移液管中水温波动引起的不确定度。实验室的环境温度为（20+4）℃，校正环境温度为20 ℃，水温的最大波动为4 ℃，水的膨胀系数为2.1×10-4 ℃-1，

按矩形分布，k=，则1 mL和10 mL移液管中水温波动引起的标准不确定度分别为

故样品稀释中由1 mL和10 mL移液管引入的标准不确定度为

样品稀释中由1 mL和10 mL移液管引入的相对标准不确定度为

则样品稀释体积引入的相对标准不确定度为

2.2.2 样品吸取体积引入的相对标准不确定度urel（V2）

样品吸取体积引入的不确定度属于B类不确定度。本文每个稀释液接种1 mL至普通琼脂培养平皿中，并做1个平行，同时用生理盐水做空白对照，因此需要用到1 mL移液管2次，那么样品吸取体积引入的相对标准不确定度为

2.2.3 培养基配制引入的相对标准不确定度urel（W）

培养基配制引入的不确定度属于B类不确定度。本文根据《生活饮用水标准检验方法 第12部分：微生物指标》（GB/T 5750.12—2023）方法，需要称取蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂，用量筒量取1 000 mL蒸馏水进行溶解，配制普通琼脂培养基。培养基配制不确定度来源于天平校正产生的不确定度及量取蒸馏水产生的不确定度，具体见表1。其中，电子天平校正证书扩展不确定度（允差）U=0.05 g根据表1计算得出培养基配制引入的相对标准不确定度为

2.2.4 培养条件和重复测定结果引入的相对标准不确定度urel（X）

因培养条件包含在重复测定中，不再单独评定，只评定重复测定结果，而重复测定结果引入的不确定度属于A类不确定度。同一水样重复测定10次，检测结果如表2所示。根据表2计算得出残差平方和为 根据贝塞尔公式计算出培养条件和重复测定结果引入的标准不确定度为则培养条件和重复测定结果引入的相对标准不确定度为

2.3 相对合成标准不确定度

根据2.2中各分量的相对标准不确定度结果，获得相对合成标准不确定度结果为

2.4 扩展不确定度及测定结果报告

对上述10个重复水样进行菌落总数分析，自由度为n-1=9，取包含因子k=2（置信概率近似95%），则扩展不确定度为

因此，10个重复测定水样的菌落总数取对数的结果报告为

取反对数后，10个重复测定水样的菌落总数结果报告为280～320 CFU·mL-1。

2.5 农村饮用水中菌落总数结果分析

对城郊和山区4种中小型集中式供水和分散式供水水源（包括溪水、地下水、水库水和河水）进行菌落总数测定，根据扩展不确定度值计算获得8份水样的菌落总数结果为170～380 CFU·mL-1，均低于国家标准要求的500 CFU·mL-1，符合GB 5749—2022要求（表3）。山区水源中，水库水菌落总数最多，其次分别是溪水、河水和地下水；城郊水源中，河水菌落总数最多，其次分别为溪水、地下水和水库水。

3 讨论与结论

本文对农村饮用水菌落总数进行测量不确定度评定，并根据扩展不确定度值计算8份农村饮用水菌落总数，得出菌落总数为170～380 CFU·mL-1，均低于国家标准要求的500 CFU·mL-1，符合GB 5749—2022要求，且其不确定度值符合实验室质量控制要求[4]。对比分析各分量的相对标准不确定值发现，重复测定和培养基配制引入的不确定度贡献较大，其次是样品稀释体积和样品吸取体积引入的不确定度。蔡晓霞等[5]研究发现，在食品中菌落总数测定中，样品重复测定对测量不确定度贡献最大，与本研究结果基本一致。本研究结果可为今后进一步规范农村饮用水菌落总数检测步骤，减少实验误差，确保实验结果的准确性，降低结果的误判风险提供可靠依据。

参考文献

[1]范凌玲，李凡卡，于亚乐，等.2016年新疆兵团生活饮用水水质影响因素调查与分析[J].现代预防医学，2017，44（17）：3250-3253.

[2]吕萍萍.饮用水微生物指标与介水传染病相关性研究[D].北京：中国疾病预防控制中心，2017.

[3]刘丽，刘伶俐，陈湘艺，等.微波消解-原子荧光光谱法测定扇贝中总汞的不确定度评定[J].中国渔业质量与标准，2012，2（3）：39-44.

[4]李智.滤膜法测定地表水中粪大肠菌群的测量不确定度评定方法研究[J].环境与发展，2022，34（8）：72-75.

[5]蔡晓霞，吴家碧，陈叶兰，等.菌落总数测定结果的不确定度评定[J].农产品加工，2022（12）：68-71.

基金项目：湖南省大学生创新创业训练计划项目（S202210547043）；湖南省教育厅科学研究项目（22C0468）。