超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中的4种酚丁
作者: 刘丹阳 寻知庆 黄志宁 周俏婷
摘 要:建立采用超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中4种酚丁的分析方法。样品经80%甲醇提取,Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)色谱柱分离,乙腈-0.1%甲酸水溶液洗脱,采用三重四极杆质谱仪分析。结果表明,4种酚丁在1.0~100.0 ng·mL-1时线性关系良好,相关系数均大于0.999;检出限均为10 μg·kg-1,定量限均为20 μg·kg-1,回收率为85.7%~94.5%,相对标准偏差为2.9%~5.0%。该方法灵敏度高、准确度高,适用于食品中的4种酚丁的检测。将方法应用于市售30种不同类型的食品中,共筛查出3例阳性样品,检出率为10.0%。
关键词:食品安全;非法添加;酚丁;高效液相色谱-串联质谱法
Simultaneous Determination of 4 Kinds of Oxyphenisatin in Food by Ultra-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
LIU Danyang, XUN Zhiqing*, HUANG Zhining, ZHOU Qiaoting
(Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute, Guangzhou 511447, China)
Abstract: An analytical method for the simultaneous determination of four oxyphenisatin in food by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry was established. Samples were extracted with 80% methanol, separated on a Waters ACQUITY UPLC HSS T3 (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm) column, eluted with acetonitrile-0.1% formic acid solution, and analyzed by a triple quadrupole mass spectrometer. The results showed that the four oxyphenisatin concentrations were 1.0 ng·mL-1 to 100.0 ng·mL-1 with good linear relationship, the correlation coefficients were greater than 0.999; the detection limit is 10 μg·kg-1, and the quantification limit is
20 μg·kg-1, the recoveries were 85.7% to 94.5%, and the relative standard deviations were 2.9% to 5.0%. This method has high sensitivity and accuracy, and is suitable for the detection of four oxyphenisatin in food. The method was applied to 30 different types of food on the market, and a total of 3 positive samples were screened, with a detection rate of 10.0%.
Keywords: food safety; illegal additives; oxyphenisatin; ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
随着人们生活水平的提高,我国超重肥胖人数逐年上升[1]。肥胖不仅影响外貌,损害代谢,甚至可能导致心血管疾病、糖尿病、癌症等疾病[2]。酚丁类化合物属于致泻类药物,服用后会刺激肠道加速蠕动,可引发腹泻,进而导致体重减轻,大量摄入会诱发结肠炎甚至危及生命[3]。为谋取利益,不法商家会在食品或保健食品中非法添加这些物质,危害消费者的健康[4]。双醋酚丁、双丙酚丁等时常在食品抽查中有所检出,同时新型酚丁衍生物如双己酚丁和5-氯双醋酚丁等,在保健食品或食品中的添加现象也偶有发现[5-6]。因此,对食品中酚丁进行监测非常重要。目前,食品中酚丁类化合物常用分析检测方法包括液相色谱法、液相色谱-串联质谱法和高分辨质谱法等,但研究多集中在双醋酚丁和双丙酚丁,双己酚丁和4-氯双醋酚丁相关分析方法的较少[5,7]。基于此,本研究建立了一种采用超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中4种酚丁的分析方法,以弥补现有检测方法的空白。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
压片糖果、固体饮料和果冻等30种食品,网络相关平台及当地市场购买。双醋酚丁、4-氯双醋酚丁,大道生物科技;双丙酚丁,阿尔塔;双己酚丁,湖北扬信医药科技有限公司;甲醇、甲酸,德国默克;乙腈,美国Fisher公司。
1.2 仪器与设备
超高效液相色谱仪(SHIMADZU LC-30AD);三重四极杆质谱仪(AB SCIEX Triple Quad 5500);超声波清洗仪(舒美KQ-500E);电子天平(梅特勒ME204);Milli-Q去离子水发生器(默克Direct 8)。
1.3 实验方法
1.3.1 标准溶液配制
(1)标准储备液配制。分别准确称取适量双醋酚丁、双丙酚丁、双己酚丁和4-氯双醋酚丁标准物质(精确至0.01 mg),用甲醇配制成100.0 μg·mL-1的标准储备液,2~8 ℃储存。
(2)混合标准中间液配制。分别准确移取
100 μL双醋酚丁、双丙酚丁、双己酚丁和4-氯双醋酚丁标准储备液,用甲醇定容至10 mL容量瓶中,配制成1.0 μg·mL-1的混合标准中间液,2~8 ℃储存。
(3)混合标准工作液配制。分别精密移取适量标准中间液,用甲醇逐级稀释成质量浓度为1.0 ng·mL-1、2.5 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、25.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1和100.0 ng·mL-1的标准工作液,临用现配。
1.3.2 样品前处理
固体饮料剪去外包装后直接混匀,压片糖果使用破壁机粉碎,果冻使用破壁机混合均匀。准确称取0.5 g(精确至0.01 g)样品至10 mL离心管中,加入8 mL 80%甲醇并涡旋混匀,超声15 min后用80%甲醇定容,然后在4 000 r·min-1条件下离心5 min,上清液经0.22 μm有机滤膜过滤待测。
1.3.3 色谱条件
色谱柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);流动相:0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B);柱温:35 ℃;进样体积:5 μL;流速:0.3 mL·min-1;洗脱程序:0~2 min,40%B;2~10 min,40%→95%B;10~13 min,95%B;13~13.1 min,95%→40%B;13.1~15 min,40%B。
1.3.4 质谱条件
电喷雾离子源(Electrospray Ionization,ESI);扫描方式:ESI+;喷雾电压:5 250 V;离子源温度:400 ℃;雾化气压力:0.340 MPa;辅助气压力:0.412 MPa;气帘气压力:0.138 MPa;碰撞室出口电压:10 V;检测方式:多反应监测模式(Multiple Reaction Monitoring,MRM)。
2 结果与分析
2.1 仪器条件的优化
2.1.1 质谱条件的优化
取100 ng·mL-1的双醋酚丁、双丙酚丁、双己酚丁和4-氯双醋酚丁混合标准物质,进行质谱参数的优化。在质谱MS only的状态下,使用针泵进样,采集一级质谱信息,根据化合物相对分子质量,确定母离子(Q1)及扫描模式。结果显示,4种酚丁化合物适合在正离子模式下分析,且皆为[M+H]+峰。同样使用针泵进样,在Product Ion Scan模式下采集碎片离子信息获得4种酚丁相对应的子离子(Q3),最后进行MRM参数优化,获得每对离子对的最佳去簇电压和碰撞能量。双醋酚丁、双丙酚丁和双己酚丁响应最高的碎片离子皆为224.1(m/z),4-氯双醋酚丁为258.1(m/z),将其作为定量离子,响应次之者作为定性离子,详见表1。
2.1.2 色谱条件的优化
本文对3种不同色谱柱(BEH C18、BEH C8和HSS T3)的分离效果进行了对比。结果发现,4种酚丁化合物在上述3种色谱柱上的保留都较强,出峰靠后,在保留时间上未发现明显区别。其中,使用HSS T3色谱柱分析双醋酚丁、双己酚丁和4-氯双醋酚丁时,响应最高,且峰形最好,双丙酚丁的响应及峰形在3种色谱柱上的表现基本没有差别。综合考虑,后续实验采用HSS T3色谱柱。此外,本文还比较了乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水溶液两种流动相系统,结果显示,使用乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相时,4种酚丁的峰形尖锐、对称。因此,本文选择乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相。优化后,混合标准物质
(100 ng·mL-1)的色谱图如图1所示,双醋酚丁、双丙酚丁、双己酚丁和4-氯双醋酚丁的保留时间分别为9.60 min、11.00 min、13.46 min和10.26 min。
2.2 方法学验证
2.2.1 线性范围、检出限和定量限
按1.3.1项方法配制标准系列溶液,以标准物质系列浓度为横坐标,以其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线,结果见表2。4种化合物在1.0~100.0 ng·mL-1时,线性关系良好,相关系数(r2)均大于0.999。以3倍信噪比和10倍信噪比计算方法的检出限和定量限,4种化合物的检出限均为10.0 μg·kg-1,定量限均为20.0 μg·kg-1。
2.2.2 回收率和精密度
由表3可知,在20.0 μg·kg-1、40.0 μg·kg-1、200.0 μg·kg-1 3个加标水平下,4种目标化合物的加标平均回收率在85.7%~94.5%,相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)在2.9%~5.0%。表明该方法具有灵敏度高和准确性好等特点,适合用于食品中4种酚丁化合物的分析。
2.3 实际样品测定
采用本方法对市售30种食品中4种酚丁化合物进行检测,共筛查出3例阳性,阳性比例为10.0%。其中一份样品中添加了双醋酚丁和4-氯双醋酚丁,添加量分别为0.23 mg·kg-1和678 mg·kg-1;另外两份样品中添加了双己酚丁,添加量分别为6.84 mg·kg-1和614.72 mg·kg-1。上述结果显示,食品中酚丁的非法添加现象较为严重,且不法商家为逃避监管更偏向于选择新型化合物。
3 结论
本研究建立了采用超高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中的4种酚丁的分析方法,结果表明,在1.0~100.0 ng·mL-1,4种化合物的相关系数(r2)均大于0.999,检出限均为10.0 μg·kg-1,定量限均为20.0 μg·kg-1。3个加标水平下,样品的平均加标回收率为85.7%~94.5%,相对标准偏差为2.9%~5.0%。该方法线性关系良好,灵敏度高,准确性好,适用于食品中的非法添加化合物酚丁的检测。
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