半制备整体柱液相色谱法测定食品中泛酸的含量

摘 要：目的：建立半制备整体柱液相色谱法测定食品中泛酸含量的分析方法。方法：样品中泛酸用热水提取，以磷酸二氢钾溶液和乙腈为流动相，流速2 mL·min-1，进样量500 μL，柱温30 ℃，检测波长

200 nm，经Merck半制备整体柱净化，在泛酸出峰处收集溶液，收集液经反相C18柱定量分析。结果：泛酸浓度在0.001～0.032 μg·L-1具有良好的线性关系，相关系数为0.999 9，方法检出限为0.025 mg/100 g，定量限为0.08 mg/100 g，泛酸在食品中测定结果的相对标准偏差为2.4%～3.6%，加标回收率均大于90%。结论：针对含有蛋白、肽、淀粉等复杂基质的食品，本半制备整体柱液相色谱法的检测一致性较好，分离度、精密度、准确性等均符合要求。有效解决复杂基质、杂质干扰下目标峰难分离、检测结果不稳定、平行差的问题。

关键词：高效液相色谱；泛酸；半制备整体柱

Determination of Pantothenic Acid in Food by Semi-Preparative Monolithic Column Liquid Chromatography

CHEN Hanfeng， YANG Jing， LI Junwei， HOU Shaoping， LIU Chunli

（Access （Guangzhou） Testing Technology Service Co.， Ltd.， Guangzhou 510730， China）

Abstract： Objective： To establish.an analytical method for the determination of pantothenic acid content in food using semi-preparative monolithic column liquid chromatography. Method： Pantothenic acid in the sample is extracted with hot water， using a solution of potassium dihydrogen phosphate and acetonitrile as the mobile phase， with a flow rate of 2 mL·min-1， an injection volume of 500 μL， a column temperature of 30 ℃， and a detection wavelength of 200 nm. The solution is purified on a Merck semi-preparative monolithic column， and the solution is collected at the elution peak of pantothenic acid. The collected liquid is then quantitatively analyzed on a reverse-phase C18 column. Result： Pantothenic acid exhibits good linearity within the concentration range of 0.001～0.032 μg·L-1， with a correlation coefficient of 0.999 9. The limits of detection is 0.025 mg/100 g， and limits of quantification is 0.08 mg/100 g. The relative standard deviation of the pantothenic acid determination results in food is between 2.4% and 3.6%. The recovery rates of spiked samples are greater than 90%. Conclusion： For foods containing complex matrices such as proteins， peptides， and starch， this semi-preparative monolithic column liquid chromatography method demonstrates good consistency in detection， with separation， precision， and accuracy all meeting the necessary standards. It effectively addresses issues such as difficult peak separation， unstable detection results and poor parallelism under complex matrices and impurity interference.

Keywords： high performance liquid chromatography; pantothenic acid; semi-preparative monolithic column

泛酸又称为维生素B5，是一种水溶性维生素，呈浅黄色，因广泛存在于动植物中而得名“泛酸”。其主要功效包括帮助能量代谢、维护神经系统健康、促进伤口愈合、维护免疫系统健康和促进头发和皮肤健康。人体不能自行合成泛酸，必须从食物中获取。如果缺乏泛酸，可能会引发疲劳、头痛、失眠、焦虑、消化不良和皮肤病等症状[1-5]。

常用的泛酸含量检测方法主要有微生物法，液相色谱法和荧光光度法，近年来液相色谱-串联质谱法和酶联免疫吸附测定法也逐渐被推广使用[6-11]。最新颁布实施的《食品安全国家标准 食品中泛酸的测定》（GB 5009.210—2023）第一法已从2016版的微生物法改为液相色谱法，但在实施过程中发现，当检测含有蛋白、肽、淀粉等复杂基质的样品时，存在杂质色谱峰干扰、测试结果平行性差、色谱柱损耗率高等问题[7-11]。而第二法液相色谱串联质谱法存在仪器设备昂贵、运营维护成本高、对检测人员技术要求高等问题。第三法微生物法是测定泛酸的经典方法，成本低、经济实用，但操作复杂且费时，标准化程度低、环境条件要求较高、受培养基质量影响大[6]。

本研究拟以Merck公司Chromolith半制备整体柱净化样品溶液中未能完全去除的蛋白、肽、淀粉等杂质[12]，根据标准工作溶液中泛酸出峰的开始和结束时间设定馏分的收集时间，混合均匀的收集液再经常规的C18色谱柱分离定量。Chromolith半制备柱采用独特设计的整体化硅胶，其结构包含网状的孔径大小为2 µm的大孔，以及空隙大小为

120 Å小孔。当流动相流经色谱柱时，样品液中的较大分子如蛋白质、肽类及淀粉等杂质会迅速通过2 µm的大孔，而目标物质——小分子泛酸则在更大活性表面积的120 Å小孔中进行高效液相分离。同时，整体柱大孔结构具有极强抗污染能力，可在持续大体积进样的情况下保持较高的柱效；在高流速下柱反压小，相同流速下压力仅为普通色谱柱的1/4，在馏分收集过程中可以使用更高的流速进行快速分离与净化，有助于减少溶剂消耗和缩短净化时间。经过净化后的样品溶液只有较少的杂质成分，根据GB 5009.210-2023第一法的色谱条件，泛酸峰与相邻杂质之间能够实现良好的分离效果。净化后的样品液不会对后续用于分离定量分析的色谱柱造成柱头污染，从而显著延长分析用色谱柱的使用寿命。综上所述，Chromolith半制备整体柱提供了一种高效、快速且经济的样品净化方案，有助于提高泛酸测定的准确性和效率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

食品样品A混合营养餐，样品B代餐奶昔均购于商场；泛酸钙标准品；淀粉酶；磷酸二氢钾、乙腈、三氟乙酸、磷酸（色谱纯）；盐酸、氢氧化钠、硫酸锌（分析纯）；一级水。

1.2 仪器与设备

2695高效液相色谱仪带紫外检测器和大体积定量环（Waters公司）、WFCIII馏分收集器（Waters公司）、半制备整体柱（Chromolith SemiPrep RP-18e色谱柱，Merck公司）、分析用色谱柱（Eclipse XDB-C18色谱柱，Agilent公司）、3K15高速冷冻离心机（Sigma公司）、ST 3100 pH计（Thermo公司）、AR224CN电子天平（Mettler公司）和SW22恒温振荡水浴箱（Julaba公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 标准品配制

参考《食品安全国家标准 食品中泛酸的测定》（GB 5009.210—2023）第一法3.4配制标准溶液。

1.3.2 样品处理

参考GB 5009.210—2023第一法5.2.2处理复杂基质样品，过滤上清液至2 mL样品瓶中，放入带有馏分收集器的液相色谱仪进行泛酸的馏分收集。将泛酸标准工作溶液的收集液、待测试样的收集液分别混合均匀，转移至2 mL液相用样品瓶中进行上机分析，测量峰面积并定量计算。

1.3.3 色谱条件

（1）馏分收集半制备色谱条件。色谱柱：Merck公司Chromolith SemiPrep RP-18e（10 mm×100 mm）；流速：2.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：500.0 μL；检测波长：200 nm；流动相：0.1%三氟乙酸水溶液和乙腈按95∶5（V/V）混合；根据最大浓度的标准工作液中泛酸的出峰时间设定收集时间。出峰情况见图1。

（2）分析用色谱条件。色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：50.0 μL；检测波长：200 nm；流动相：磷酸二氢钾水溶液和乙腈按97∶3（V/V）混合。出峰情况见图2。

2 结果与分析

2.1 专属性实验

制备样品B空白基质样品，按照1.3.2处理样品，1.3.3色谱条件上机测定，泛酸标准工作液的出峰时间为7.26 min（图2），对比空白基质样品在此处无干扰峰（图3）。

2.2 线性范围

根据GB 5009.210—2016的标准工作溶液配制方法，配制浓度在0.001～0.032 μg·L-1的6个浓度点的工作溶液，上机测试，以标准工作液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线（图4）。曲线的线性回归方程为Y=6.54×103X+112，相关系数R2=0.999 9。

2.3 检出限和定量限

配制低浓度的试样溶液，馏分收集后进样得到色谱峰，计算出待测组分的信噪比。当信噪比（S/N）为3时，泛酸检出限为 0.025 μg·mL-1；样品称样量 5 g，定容 50 mL时，该方法的泛酸检出限为0.025 mg/100 g。当信噪比（S/N）为 10时，泛酸定量限为0.08 µg·mL-1；样品称样量5 g，定容50 mL时，该方法的泛酸定量限为0.08 mg/100 g。

2.4 精密度

按照样品处理方法和色谱条件，平行测定6份样品，分别计算样品中泛酸的含量及相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。如表1所示，结果显示2种样品测定结果的RSD在2.4%～3.6%，满足《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》（GB/T 27417—2017）中RSD小于7.5%的要求，该方法精密度良好[13]。