QuEChERS-高效液相色谱串联质谱法测定猪肉中氟苯尼考残留量

摘 要：目的：建立QuEChERS净化结合高效液相色谱串联质谱法测定猪肉中氟苯尼考残留量的分析方法。方法：样品经捣碎均质化后用乙腈提取，提取液经QuEChERS净化，使用C18柱分离，以乙腈和超纯水为流动相进行洗脱，采用全扫描、多反应监测模式检测，内标法定量。结果：在0～50 μg·L-1浓度范围内氟苯尼考具有良好的线性关系，相关系数R2≥0.999，定量限为0.02 μg·kg-1，检出限为0.01 μg·kg-1；在10 μg·kg-1、20 μg·kg-1、50 μg·kg-1 3个添加浓度水平下，加标回收率为98.2%～108.5%，RSD为3.24%～5.75%。结论：该方法前处理操作简单，准确度和灵敏度高，满足猪肉中氟苯尼考残留量的检测要求。

关键词：氟苯尼考；QuEChERS；高效液相色谱串联质谱法；猪肉

Determination of Florfenicol Residues in Pork by QuEChERS-HPLC-MS/MS

LUO Jiaer， OU Jialing

（Guangdong Huizhou Quality and Measuring Supervision Testing Institute， Huizhou 516000， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of florfenicol residue in pork by QuEChERS cleanup combined with high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Method： The sample was crushed and homogenized and then extracted with acetonitrile. The extract was cleaned up by QuEChERS and separated by C18 column. Acetonitrile and ultrapure water were used as mobile phases for elution. Full scan and multiple reaction monitoring mode were used for detection and internal standard method for quantification. Result： Florfenicol had a good linear relationship in the concentration range of 0～50 μg·L-1， with correlation coefficient R2≥0.999， limit of quantification of 0.02 μg·kg-1， and limit of detection of 0.01 μg·kg-1. At the three spiked concentration levels of 10 μg·kg-1， 20 μg·kg-1， and 50 μg·kg-1， the recoveries were 98.2%～108.5%， and the RSD were 3.24%～5.75%. Conclusion： This method has simple pretreatment operation， high accuracy and sensitivity， and meets the requirements for the detection of florfenicol residues in pork.

Keywords： florfenicol; QuEChERS; high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; pork

氟苯尼考别名氟甲砜霉素，是第三代氯霉素抗生素产品，分子式为C12H14Cl2FNO4S，为白色或类白色结晶性粉末。氟苯尼考具有抗菌谱广、高效、价格低等特点，对巴氏杆菌、大肠杆菌等都有较强的抗菌作用。氟苯尼考适用于治疗对氟喹诺类等抗菌药物有耐药性的细菌感染，被广泛应用于猪传染性胸膜肺炎、猪肺疫等疾病的治疗。然而，氟苯尼考在体内分布广、半衰期长，且具有胚胎毒性和耐药性，用于动物疾病防治时使用不当可能导致药物残留，最终危害人类健康[1]。

氟苯尼考残留量的常用检测方法包括酶联免疫法、液相色谱法、气相色谱串联质谱法及液相色谱串联质谱法。相比较而言，液相色谱-串联质谱联用法具有灵敏度高、选择性好、定性定量准确、无须衍生化等优点，成为检测氟苯尼考的首选方法[2-4]。在前处理环节，常用净化方式有固相萃取净化法、分子印迹净化法等，该类净化方式存在试剂消耗量大、耗时长、操作复杂、损失大等问题[5]。与常用净化方式相比，QuEChERS具有操作简单快速、安全可靠、能有效去除脂肪、有机酸等杂质的优点[6-9]。本文通过优化前处理条件，建立了一种灵敏度高、高效、成本低、回收率好的QuEChERS结合高效液相色谱-串联质谱法检测猪肉中氟苯尼考残留量的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉，市售；氟苯尼考标准品（CAS：73231-34-2，99.7%）坛墨质检；氯霉素-D5（CAS：202480-68-0，100.9 μg·mL-1），BePure；甲醇、乙腈（色谱纯），默克；一级水。

1.2 仪器与设备

API 4000超高效液相色谱-质谱联用仪，AB SCIEX；ZORBAX Extend-C18柱，安捷伦；万分之一天平，塞多利斯科学仪器（北京）有限公司；H1750R冷冻离心机，湖南湘仪实验仪器开发有限公司；DC-24型氮吹仪，上海安谱科学设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

标准储备液：准确称取氟苯尼考标准品0.010 0 g，置于10 mL容量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成氟苯尼考标准储备液，浓度为1 000 μg·mL-1，置于-18 ℃保存。临用前用甲醇稀释为100 μg·L-1的标准中间液。氯霉素-D5内标储备溶液：准确吸取氯霉素-D5内标溶液0.1 mL，置于10 mL容量瓶，以甲醇定容后摇匀，配制成浓度为1 μg·mL-1内标标准储备溶液，置于-18 ℃保存。系列标准工作溶液：量取标准中间液和氯霉素-D5内标储备溶液，用10%乙腈稀释，配制成氟苯尼考浓度为0 μg·L-1、1 μg·L-1、2 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1和50 μg·L-1，氯霉素-D5浓度为10 μg·L-1的系列标准溶液。

1.3.2 样品处理

样品制备：称取约 600 g市售猪肉样品，捣碎混匀后装入洁净容器中。

样品提取：准确称取制备好的猪肉样品5 g（±0.01 g），置于50 mL离心管中，同时加入10 mL乙腈和10 μL内标储备液，加入缓冲盐包后涡旋振荡10 min，再在6 000 r·min-1转速下离心5 min，得到上清液。

净化和浓缩：转移上述上清液至净化管中，涡旋混匀10 min，在13 000 r·min-1转速下离心5 min，取5 mL上清液置于10 mL离心管中，在40 ℃下，氮气吹至近干。加入1.0 mL 10%乙腈水溶液复溶，混匀过0.22 μm滤膜后，待检测。

空白基质液：按上述方法处理后经检定为阴性的样液，为空白基质液。

1.3.3 测定条件

（1）色谱条件。色谱柱：ZORBAX Extend-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：A为超纯水，B为乙腈；流速：0.6 mL·min-1；进样量：5 μL；柱温：40 ℃；洗脱方式：等梯度洗脱（35%A，65%B）。

（2）质谱条件。电喷雾离子源负离子（ESI-）；离子源温度：500 ℃；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测；离子化电压：-4.5 kV；喷雾气：50 psi；碰撞气能量：6 V。

2 结果与分析

2.1 实验条件优化

2.1.1 样品提取剂优化

选择乙腈、乙酸乙酯、3%氨化乙腈、3%氨化乙酸乙酯等4种提取剂对样品中氟苯尼考进行提取，回收率结果见表1。使用乙腈为样品提取剂时，回收率较高，满足实验需求。考虑氨水及乙酸乙酯具有挥发性和强刺激性，本实验采用10%乙腈作为猪肉样品的提取剂。

2.1.2 净化方式优化

分别采用QuEChERS与MCX柱对样品进行净化处理。结果显示，QuEChERS净化，氟苯尼考的平均回收率为99.7%；MCX柱净化，氟苯尼考的平均回收率为92.6%，QuEChERS净化的回收率更高。考虑MCX柱需要活化、洗脱，步骤烦琐，使用的有机溶剂种类多，洗脱过程中人为操作难度较大、回收率不稳定、效率较低，本实验采用QuEChERS法净化样品。

2.1.3 流动相的优化

在流动相A为10 mmol·L-1甲酸铵溶液、超纯水的情况下，取氟苯尼考系列标准工作液进行检测。结果显示，流动相A为超纯水可提高离子化效率和改善峰形，且氟苯尼考的响应值更高。

2.1.4 质谱条件优化

在多反应监测模式下，对碰撞电压、碰撞能量进行优化；同时，以全扫描方式对浓度为

0.1 mg·L-1的氟苯尼考标准溶液进行扫描检测，以确定定性离子对和定量离子对，最终确定质谱条件见表2。

2.2 方法验证

2.2.1 专属性

分别测定空白基质液（阴性样品溶液）、

10 μg·kg-1标准溶液、阳性样品溶液，记录色谱图，见图1。可见，在测定条件下，氟苯尼考响应强度好，未受样品基质及溶剂的干扰。

2.2.2 线性范围、检出限与定量限

测定1.3.1配制的系列标准工作溶液，以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线；线性方程为Y=0.131X+0.076 1，相关系数R2=0.999 5，表明线性关系良好。以3倍信噪比计算检出限为

0.01 μg·kg-1、10倍信噪比计算定量限为0.02 μg·kg-1，方法检出限与定量限较低，满足测定要求。

2.2.3 加标回收率

对阴性样品添加适量标准中间液，使加标浓度为0 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1，经前处理后测定。如表3所示，加标平均回收率为98.2%～108.5%，RSD为3.24%～5.75%，可见方法准确可靠。

2.3 样品检测

取市售的20份猪肉样品，经样品前处理后测定，对其中5份加标（加标量10 μg·L-1）进行质量把控。5份加标样品测定值为（9.79±0.01）μg·kg-1，其余15份样品均未检出，检测结果稳定可靠。

3 结论

本研究通过优化实验条件，建立了QuEChERS净化结合高效液相色谱串联质谱法检测猪肉中氟苯尼考残留量的分析方法。该方法测定干扰小、准确度好、灵敏度高，适用于猪肉中氟苯尼考的测定。

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