高效液相色谱法测定乳饮料中纽甜含量

作者: 李磊 谢梦 方娟 张昊 马后扬 吴建勋

高效液相色谱法测定乳饮料中纽甜含量0

摘 要:在《食品安全国家标准 食品中纽甜的测定》(GB 5009.247—2016)的基础上优化样品前处理条件和色谱参数,建立高效液相色谱法测定乳饮料中纽甜的方法。结果显示,在0~20 μg·mL-1浓度范围内方法线性关系良好,相关系数R2=0.999 9,加标回收率为99.0%~105.5%,相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)≤1.46%。可见方法精密度及准确度高,适用于乳饮料中纽甜的测定。

关键词:纽甜;方法优化;高效液相色谱法

Determination of Neotame Content in Milk Beverages by HPLC

LI Lei, XIE Meng, FANG Juan, ZHANG Hao, MA Houyang, WU Jianxun

(Mengniu Dairy Products Wuhan Co., Ltd., Wuhan 430040, China)

Abstract: By optimizing sample pretreatment conditions and chromatographic parameters based on GB 5009.247—2016, a method for the determination of neotame in milk beverages by high performance liquid chromatography was established. The results showed that the method had a good linear relationship in the concentration range of 0~20 μg·mL-1, with a correlation coefficient of R2=0.999 9, a spike recovery rate of 99.0%~105.5%, and the relative standard deviation (RSD)≤1.46%. It can be seen that the method has high precision and accuracy and is suitable for the determination of neotame in milk beverages.

Keywords: neotame; method optimization; high performance liquid chromatography

近年来,随着全球肥胖率的显著上升,人们对人工甜味剂(Artificial Sweeteners,AS)等糖替代品的需求大幅上升。纽甜作为AS中一种几乎不含热量的甜味剂,凭借其在人体内快速代谢的特点,被广泛应用于饮料、乳制品、甜点、烘焙糕点等食品加工领域。然而,人工甜味剂的安全性却始终存在争议,国际食品法典委员会以及中国、美国、日本也均对纽甜有严格的限量要求[1]。因此,在生产过程中对纽甜添加量进行控制是必不可少的,纽甜含量检测也成为各大食品相关实验室需要具备的能力[2-4]。《食品安全国家标准 食品中纽甜的测定》(GB 5009.247—2016)[5]为食品中纽甜检测的通用方法,但针对不同领域、不同基质,该方法还有进一步优化的空间。本文针对乳饮料领域进一步优化该方法,旨在减小干扰,提高纽甜含量检测的稳定性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Ultimate 3000高效液相色谱仪(VWD检测器,配Chromeleon软件),Thermo;XP205DR分析天平(精度为0.000 1 g),METTLER;SB-4200DT超声波清洗仪,宁波新芝生物科技股份有限公司;Neofuge 23R离心机,Heal Force;MS3 DS25旋涡振荡器,IKA;N-EVAP 112氮吹仪,Organomation;Millipore Synergy超纯水机。Agela Venusil XPB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);0.45 μm滤膜(有机系);乙腈(色谱纯),Cleman;辛烷磺酸钠(色谱纯),Fisher;磷酸(优级纯),甲酸、甲醇、三乙胺(色谱纯),天津福晨化学试剂有限公司;纽甜标准物质(纯度99.2%),坛墨质检标准物质中心。

1.2 实验方法

1.2.1 试剂配制

混合提取液:吸取0.8 mL甲酸和2.5 mL三乙胺,用超纯水定容至1 000 mL。

离子对缓冲液:称取2.00 g辛烷磺酸钠,用约500 mL超纯水溶解后,加入1.0 mL磷酸,用超纯水定容至1 000 mL。

1.2.2 标准品配制

标准储备液:准确称取0.100 0 g纽甜标准品,加混合提取液溶解并定容至100 mL,此溶液纽甜含量为1 000 μg·mL-1。

标准中间液:准确吸取1.00 mL纽甜标准储备液,加混合提取液定容至10 mL,此溶液纽甜含量为100 μg·mL-1。

标准系列工作液:分别吸取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL和2.0 mL纽甜标准中间液,用混合提取液定容至10 mL,此系列溶液纽甜含量分别为0 μg·mL-1、2 μg·mL-1、4 μg·mL-1、6 μg·mL-1、8 μg·mL-1、10 μg·mL-1和20 μg·mL-1。

1.2.3 样品前处理

准确称取10.0 g试样于50 mL容量瓶中,加入30 mL混合提取液,旋涡混匀。超声15 min,用混合提取液定容至刻度,混匀后移至离心管,8 500 r·min-1离心10 min,滤纸过滤;吸取10.0 mL的滤液加入用5 mL甲醇、10 mL水活化后的C18固相萃取柱,待滤液完全流出后,用5 mL的混合提取液淋洗萃取柱,弃去全部流出液,加入5 mL甲醇洗脱至试管中;洗脱液40 ℃氮气吹干,加入2.0 mL混合提取液定容,漩涡振荡60 s,经0.45 μm滤膜过滤后上机分析。

1.2.4 仪器参数

色谱柱:Venusil XBP C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温:30 ℃;流动相:乙腈∶离子对缓冲液=43∶57;流速:1.0 mL·min-1;检测波长:218 nm;进样量:20 μL。

2 结果与分析

2.1 实验条件优化

2.1.1 调整进样体积

GB 5009.247—2016中进样体积为50 μL,在实际检测中,由于进样量过大,目标峰会出现较为严重的峰展宽和拖尾情况,影响定性及定量的准确性。本实验室对多个进样体积进行测试发现,当进样体积为20 μL时,大部分曲线点具有较好的峰形;进样量继续下调后,目标峰会出现前延,且响应值过小,不满足检测需求。因此,将进样体积调整为20 μL,调整后各曲线点不对称因子得到明显改善(不对称因子=1时,峰形最佳),具体结果如表1所示。

2.1.2 调整曲线范围

GB 5009.247—2016中曲线范围为0~100 μg·mL-1,但由于50 μg·mL-1、100 μg·mL-1含量较大,在调整进样体积后,仍无法达到理想的峰形,故将曲线范围调整为0~20 μg·mL-1。调整后各曲线点峰形良好,且具有更好的定性稳定性和曲线线性(表2)。对于高值样品,可以稀释至0~20 μg·mL-1后检测。

2.1.3 调整流动相比例

GB 5009.247—2016中流动相条件为乙腈和离子对缓冲液梯度洗脱,在实际检测中,乳饮料样品在目标峰处存在大量基质干扰。经本实验室多次调节,当流动相设置为乙腈∶离子对缓冲液=43∶57时,目标峰处基线平稳,无杂峰干扰,使定性更为准确。流动相调整前后对比如图1所示。

2.2 方法验证

2.2.1 校准曲线

将纽甜标准系列工作液依次上机检测,以标准工作液的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。当纽甜标准工作液浓度在0~20 μg·mL-1时,回归方程为y=0.214 7x+0.018 2,相关系数为R2=0.999 9,纽甜线性关系良好。

2.2.2 加标回收率测定

取两类乳饮料产品,称取10 g试样后,分别添加0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL纽甜标准中间液,加标浓度分别为2.00 mg·kg-1、3.00 mg·kg-1、4.00 mg·kg-1、5.00 mg·kg-1。按照1.2.3进行样品前处理,后上机检测,结果如表3所示。回收率在99.0%~105.5%,平均值为101.53%,结果均符合标准要求(80%~110%),方法准确性良好。

2.2.3 平行精密度测定

取6批试样进行平行样检测,结果如表4所示。相对标准偏差( Relative Standard Deviation, RSD)最大为1.46%,小于方法10%的要求,方法精密度良好。

3 结论

本文在GB 5009.247—2016基础上优化了乳饮料中纽甜的检测方法。在0~20 μg·mL-1浓度范围内,方法线性关系良好,R2=0.999 9,加标回收率为99.0%~105.5%。该方法减少了基质干扰,精密度及准确度较高,适用于乳饮料中纽甜的测定。

参考文献

[1]吴鹏,张成云,朱旭丽,等.人工甜味剂对人体的影响及国内外标准现状探讨[J].食品科学,2024,45(15):383-392.

[2]朱世翠,陆思嘉,宋亚丽,等.典型饮水系统中人工甜味剂三氯蔗糖的调查[J].浙江大学学报(工学版),2019,53(11):2197-2205.

[3]谢鹏,刘星,杨旭萍.常见人工甜味剂的介绍及其发展建议[J].现代食品,2021(3):77-82.

[4]赵丽涛.毛细管电泳电容耦合非接触电导检测用于血液离子和人工甜味剂的检测[D].兰州:兰州大学,2020.

[5]国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品中纽甜的测定:GB 5009.247—2016[S].北京:中国标准出版社,2016.

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