高效液相色谱法检测玉米及其制品中黄曲霉毒素B1的含量

摘 要：本文建立了高效液相色谱检测玉米及其制品中黄曲霉毒素B1含量的方法。试样用甲醇-水溶液涡旋振荡提取，提取液经免疫亲和柱净化，氮吹浓缩，供高效液相色谱-荧光检测器测定。结果表明，黄曲霉毒素B1在0.1～20.0 ng·mL-1范围内线性关系良好，方法检出限为0.02 μg·kg-1，定量限为0.05 μg·kg-1，加标回收率在89.0%～98.7%，相对标准偏差为1.24%～4.39%。本方法适用于玉米及其制品中黄曲霉毒素B1含量的检测。

关键词：高效液相色谱法；玉米；黄曲霉毒素B1

Detection of Aflatoxin B1 Content in Corn and Its Products by High-Performance Liquid Chromatography

Abstract： A method for detecting aflatoxin B1 content in corn and its products using high-performance liquid chromatography has been established in this paper. The sample was extracted by vortex oscillation with methanol water solution， and the extract was purified by an immunoaffinity column and concentrated by nitrogen blowing for determination by high-performance liquid chromatography fluorescence detector. The results showed that aflatoxin B1 had a good linear relationship in the range of 0.1～20.0 ng·mL-1， with a detection limit of 0.02 μg·kg-1 and a quantification limit of 0.05 μg·kg-1. The recovery rate was within the range of 89.0%～98.7%， and the relative standard deviation was 1.24%～4.39%. This method is applicable for the detection of aflatoxin B1 content in corn and its products.

Keywords： high-performance liquid chromatography; corn; aflatoxin B1

黄曲霉毒素是一种由黄曲霉代谢产生的有毒物质，其中黄曲霉毒素B1的毒性最强，具有高致癌性，世界卫生组织将其定为Ⅰ类致癌物[1]。玉米是一种适应性强、产量高的粮食作物，在我国栽培历史悠久、分布范围很广，播种面积仅次于水稻、小麦，总产量则在粮食作物中居于首位[2]。玉米中富含蛋白质、维生素、纤维素和多种微量元素，一直被誉为长寿食品，也是油料和饲料的重要来源[3]。然而，玉米这种主要的粮食作物受黄曲霉毒素B1污染也最为严重，因此，加强对玉米及其制品中黄曲霉毒素B1含量的监管检测，对保障粮食和饲料安全非常重要。本研究参照《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》（GB 5009.22—2016）[4]第三法中高效液相色谱法（无衍生器法），建立了高效液相色谱法检测玉米及其制品中黄曲霉毒素B1含量的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色谱（配大流通池荧光检测器），美国沃特世公司；GL2202-1SCN分析天平（精度0.01 g），德国赛多利斯公司；XH-S旋涡混合器，无锡杰瑞安仪器公司；Multi Reax多管旋涡振荡器，德国海道尔夫公司；TG16G台式高速离心机，常州市亿能实验仪器厂；ASE-12固相萃取装置，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；HSC-B水浴氮吹仪，天津市恒奥科技发展有限公司；移液器（1 mL、10 mL）移液器，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 材料与试剂

玉米、玉米糁，购自某农贸市场；乙腈中黄曲霉毒素B1（编号91661c，浓度10 μg·mL-1），坛墨质检标准物质中心；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯），德国默克公司；氯化钠（分析纯）、氯化钾（分析纯），天津市大茂化学试剂厂；磷酸氢二钠（分析纯）、磷酸氢二钾（分析纯）、盐酸（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；Triton X-100（化学纯），上海酶联生物科技有限公司；黄曲霉毒素B1免疫亲和柱，北京泰乐祺科技有限公司。

磷酸盐缓冲溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）：准确称取4.00 g氯化钠、0.60 g磷酸二氢钠、0.10 g磷酸二氢钾、0.10 g氯化钾于烧杯中，用450 mL超纯水溶解，用盐酸溶液调节pH值至7.4，全部转移至500 mL容量瓶中，定容至刻度。

1%Triton X-100的PBS：准确吸取5.0 mL1%Triton X-100，用PBS定容至500 mL。

1.3 标准溶液配制

（1）标准中间液配制。准确吸取0.25 mL浓度为10 μg·mL-1的乙腈中黄曲霉毒素B1标准溶液于25 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容至刻度，摇匀，配制得100 ng·mL-1的黄曲霉毒素B1标准中间液。

（2）标准工作液配制。分别吸取0.01 mL、0.05 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL浓度为100 ng·mL-1的黄曲霉毒素B1标准中间液于10 mL容量瓶中，用流动相稀释定容至刻度，摇匀，配制得浓度为0.1 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1的标准工作系列溶液。

1.4 样品处理过程

（1）试样提取。称取5 g（精确至0.01 g）经粉碎后粒径小于2 mm的试样于50 mL具塞离心管中，加入20 mL甲醇-水溶液（70+30），使用旋涡混合器涡旋1 min，混匀后置于多管旋涡振荡器上涡旋振荡20 min，6 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液备用。

（2）净化测定。准确移取4.0 mL上清液于比色管中，加入23 mL 1%Triton X-100的PBS，混匀。从冰箱冷藏室中取出免疫亲和柱，待恢复至室温，将免疫亲和柱中液体放弃后，连接在50 mL注射器套管上，将混匀后的试液转移入注射器中，连接至固相萃取装置上，调节真空泵使样液以1～3 mL·min-1的流速下滴。待样液滴完后，加入10 mL超纯水淋洗免疫亲和柱并重复一次，超纯水滴完后调节真空泵抽干小柱。关闭真空泵，取下注射器，往免疫亲和柱中加入1 mL甲醇，控制以1～3 mL·min-1的流速洗脱亲和柱，用玻璃刻度试管接收洗脱液，并重复一次，最后抽干亲和柱，将全部洗脱液并入刻度试管中。将玻璃试管置于水温50 ℃的氮吹仪上，缓缓通入氮气吹至近干，用流动相定容至1.0 mL，涡旋混匀后过0.22 μm滤膜，收集滤液上机测试。

1.5 仪器工作条件

色谱柱：Waters BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）；流动相：水∶乙腈+甲醇（50+50，V/V）=65∶35；洗脱程序：等度洗脱；流速：0.30 mL·min-1；柱温：40 ℃；检测器：荧光检测器（大流通池），激发波长365 nm，发射波长436 nm；进样量：3.0 μL；根据保留时间定性，色谱峰面积比较定量。

2 结果与分析

2.1 色谱分离效果

将配制的黄曲霉毒素B1标准工作溶液按照本研究中仪器条件上机测试，色谱图如图1。黄曲霉毒素B1色谱峰尖锐对称，流动相中的溶剂峰、杂质峰也未对目标峰产生干扰，可以准确进行黄曲霉毒素B1的定性定量分析。

2.2 方法的线性关系与检出限

将配制的黄曲霉毒素B1标准工作系列溶液按照本研究中仪器条件上机测试，以标准系列溶液中黄曲霉毒素B1的质量浓度为横坐标，测得目标峰的色谱峰面积为纵坐标进行线性回归，获得的线性回归方程为Y=1.172×104X，相关系数R为0.999 9，由此看出黄曲霉毒素B1在0.1～20.0 ng·mL-1线性关系良好。称取5.00 g阴性样品，添加0.25 mL浓度为2.0 ng·mL-1的黄曲霉毒素B1标准溶液，按照1.4试样处理过程，最终定容体积为1.0 mL，按照1.5仪器工作条件上机测试，以黄曲霉毒素B1色谱峰的信噪比S/N≥3对应浓度为方法检出限、信噪比S/N≥10对应浓度为方法定量限，获得方法检出限为0.02 μg·kg-1，定量限为0.05 μg·kg-1，满足GB 5009.22—2016第三法中高效液相色谱法（无衍生器法）的要求。

2.3 方法的准确度与精密度

称取经本研究中方法检测不含黄曲霉毒素B1的阴性玉米及玉米糁样品（本底值为0 μg·kg-1），分别添加低（0.05 μg·kg-1）、中（5.00 μg·kg-1）、高（20.00 μg·kg-1）3个浓度水平的标准溶液，按照1.4试样处理过程，在1.5仪器工作条件上机测试，每个水平加标样品平行测定6次，考察方法的准确度（以加标回收率表示）与精密度（以相对标准偏差表示），结果见表1。玉米及玉米糁样品中黄曲霉毒素B1的加标回收率在89.0%～98.7%，相对标准偏差为1.24%～4.39%，方法的准确度与精密度满足《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）[5]的规定。

3 结论

本研究建立了高效液相色谱法（无衍生器法）检测玉米及其制品中黄曲霉毒素B1含量的分析方法，经试验表明，黄曲霉毒素B1色谱峰尖锐对称、分离效果较好，线性关系良好，相关系数R＞0.999，方法检出限为0.02 μg·kg-1，定量限为0.05 μg·kg-1，加标回收率在89.0%～98.7%，相对标准偏差为1.24%～4.39%，均符合GB 5009.22—2016与GB/T 27404—2008中的规定，可以满足食品检验检测机构及相关企业对玉米及其制品中黄曲霉毒素B1含量的检测需求。

参考文献

[1]顾雨熹，刘金阳，刘冬雨，等.全自动免疫磁珠法与免疫亲和柱法测定玉米粉中黄曲霉毒素B1的对比研究[J].粮食储藏，2023，52（5）：31-35.

[2]张向丽，李杰，董海军，等.浅析玉米黄曲霉影响因素及应对措施[J].农业装备技术，2024，50（3）：33-34.

[3]张艳，吴乾坤，韩逸陶，等.分级制备法评估粉碎粒径对玉米中黄曲霉毒素B1测定的影响[J].粮油食品科技，2023，31（6）：107-112.

[4]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定：GB 5009.22—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[5]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.实验室质量控制规范 食品理化检测：GB/T 27404—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.