高效液相色谱法测定固体饮料、糖果中的β-胡萝卜素

摘 要：目的：建立固体饮料、糖果中β-胡萝卜素的提取方法，利用高效液相色谱法测定样品中β-胡萝卜素含量。方法：称取均匀试样，添加抗氧化剂，加水分散溶解、石油醚-丙酮（体积比为1∶1）萃取、水洗、浓缩后复溶用高效液相色谱法测定β-胡萝卜素的含量。结果：在β-胡萝卜素含量0.5～10.0 μg·mL-1范围内，线性相关系数R=0.999 5，呈良好相关性，样品平均加标回收率在91.9%～99.3%，相对标准偏差在1.14%～3.59%。结论：该方法相较《食品安全国家标准 食品中胡萝卜素的测定》（GB 5009.83—2016）更简单、快速，能有效降低前处理过程中氧化损失，可用于固体饮料、糖果中β-胡萝卜素的测定。

关键词：高效液相色谱法；β-胡萝卜素；固体饮料；糖果

Determination of β–Carotenoids in Solid Beverages and Confectionery by High Performance Liquid Chromatography

Abstract： Objective： To establish an extraction method for β-carotene in solid beverages and candies， and to determine the content of β-carotene in the samples using high-performance liquid chromatography. Method： Weigh a uniform sample， add antioxidant， disperse and dissolve in water， extract with petroleum ether acetone （1∶1）， wash with water， concentrate， and then dissolve again. Determine the content of β - carotene by HPLC. Result： The linear coefficient R was 0.999 5 within the range of β - carotene content from 0.5 μg·mL-1 to 10.0 μ g·mL-1， showing good linearity. The sample recovery rate was from 91.9% to 99.3%， and the average relative standard deviation was from 1.14% to 3.59%. Conclusion： This method is simpler and faster compared to GB 5009.83—2016， and can effectively reduce oxidative losses during pretreatment. It can be used for the determination of β - carotene in solid beverages and candies.

Keywords： high-performance liquid chromatography; β-carotene; solid beverages; candy

β-胡萝卜素为橘黄色脂溶性化合物，是自然界中普遍存在的天然色素。β-胡萝卜素在样品中分为游离态和结合态两种形式，天然食品中的β-胡萝卜素多为结合态胡萝卜素。β-胡萝卜素具有营养保健作用以及很强的抗氧化作用，被广泛添加到食品中，一定条件下能在体内转化为维生素A，起到保护视力、预防夜盲症、干眼症等作用[1-4]。

β-胡萝卜素的常用检测方法有高效液相色谱法[5-6]、紫外-可见光谱法[7-8]、荧光光谱法[9]，其中高效液相色谱法是检测β-胡萝卜素最常用的方法。《食品安全国家标准 食品中胡萝卜素的测定》（GB 5009.83—2016）中皂化的前处理方式适用于大部分食品中β-胡萝卜素的测定。然而对于固体饮料、糖果等类别食品，β-胡萝卜素多为人工添加，本身属于游离状态，可省去皂化步骤，简化检测流程。

β-胡萝卜素分子式中的多共轭双键结构易受到外界条件，如光、热、氧等因素的影响而产生异构和转化。皂化过程中的加热、碱浓度都会影响β-胡萝卜素的测定。SUNDARESAN等[10]针对膳食补充剂中β-胡萝卜素含量测定，发现皂化会造成复合维生素-复合矿物质片中55%的β-胡萝卜素损失，而用55～60 ℃热水溶解片剂后，用有机溶剂直接提取能得到更接近样品理论值的分析结果。国内相关研究表明，皂化温度与萃取次数对胡萝卜素的检测有较大影响[11-14]。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

固体饮料1、固体饮料2、压片糖果1、压片糖果2和软糖，均为市售。β-胡萝卜素标准品，ANPEL公司；氢氧化钾、无水硫酸钠、石油醚和无水乙醇，广州化学试剂厂；抗坏血酸，Sigma公司；甲醇、乙腈、三氯甲烷和二氯甲烷，均为色谱纯，Merck公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚，Sigma公司；实验室用水（超纯水）。

UltiMate3000液相色谱仪，德国Thermo；EFAA-DC-24全自动氮吹仪，上海安谱；Milli-Q Reference超纯水系统，法国Millpore；万分之一电子天平，德国赛多利斯；旋转蒸发仪，德国Heidolph。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制

①标准储备液（100 μg·mL-1）：准确称取β-胡萝卜素对照品10.0 mg（精确到0.1 mg），加入0.25 g 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚，用二氯甲烷溶解，转移至100 mL棕色容量瓶中定容至刻度，于-20 ℃避光保存。②标准工作液：分别精密量取储备液0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL和1.00 mL标准储备液于10 mL棕色容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，摇匀，得到β-胡萝卜素的浓度分别为0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、3.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1和10.0 μg·mL-1。

1.2.2 样品前处理（不含皂化步骤）

称取1～2 g试样，加入1 g抗坏血酸，加50 mL水混匀，于25 ℃摇床振荡处理30 min后，将试液转入250 mL分液漏斗，加入50 mL萃取试剂，轻轻摇动，排气，盖好瓶塞，振摇3 min后静置分层，重复萃取3次。合并有机相，用水洗至中性，弃去水相，有机相通过无水硫酸钠过滤除水，转入旋转蒸发瓶，40 ℃减压浓缩，近干。氮气吹干，用5.00 mL二氯甲烷定容，经0.45 μm膜过滤后上机检测。

1.2.3 样品前处理（含皂化步骤）

称取1～2 g试样，加入1 g抗坏血酸，加50 mL水混匀，加入75 mL无水乙醇，摇匀，再加入25 mL 50%浓度的氢氧化钾溶液，盖上瓶塞。置于已预热至（53±2）℃恒温振荡水浴箱中，皂化30 min。取出，静置，冷却至室温。将试液转入250 mL分液漏斗，加入50 mL萃取试剂，轻轻摇动，排气，盖好瓶塞，振摇3 min后静置分层，重复萃取3次。合并有机相，用水洗至中性，弃去水相，有机相通过无水硫酸钠去除水分，转入旋转蒸发瓶，40 ℃减压浓缩，近干。氮气吹干，用5.00 mL二氯甲烷定容，经0.45 μm膜过滤后上机检测。

1.3 提取条件的优化

（1）不同萃取剂、温度、萃取次数对β-胡萝卜素含量的影响。由同一人员，同一批次样品，同一仪器，按1.2.2进行样品预处理，上机检测，分别考察不同萃取剂[石油醚（沸点：30～60 ℃）、石油醚（沸点：60～90 ℃）、石油醚-丙酮（体积比为1∶1）、丙酮、正己烷和二氯甲烷]、不同提取温度（25 ℃、40 ℃、55 ℃和70 ℃）、不同萃取次数（1次、2次、3次、4次和5次）对β-胡萝卜素含量的影响。

（2）不同浓度的氢氧化钾溶液对β-胡萝卜素含量的影响。按1.2.3进行样品预处理，上机检测，考察不同氢氧化钾溶液浓度（0%、10%、30%、50%和70%）对β-胡萝卜素含量的影响。

1.4 液相色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18液相色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），美国 Agilent；流动相：三氯甲烷∶乙腈∶甲醇=3∶12∶85，含抗坏血酸0.4 g·L-1，经0.45 μm膜过滤后备用；流速：2.0 mL·min-1；检测波长：450 nm；柱温：35 ℃±1 ℃；进样体积：10 μL。

2 结果与分析

2.1 提取条件优化

2.1.1 萃取试剂的选择

β-胡萝卜素是类胡萝卜素之一，属于脂溶性维生素，易溶于石油醚、正己烷、二氯甲烷等有机溶剂。由表1可知，石油醚-丙酮（1∶1，V∶V）对样品中β-胡萝卜素的提取效率最高，相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）也较小。

2.1.2 提取温度选择

由表2可知，试样中的β-胡萝卜素含量随着温度的升高而降低，当温度为25 ℃时，萃取效果最佳，因此选择25 ℃为实验提取温度。

2.1.3 萃取次数的选择

由表3可知，与萃取1次相比，萃取次数为3次、4次、5次时，试样中β-胡萝卜素的含量明显提升，考虑到实验时间，选择萃取次数为3次进行样品前处理测定。

2.1.4 氢氧化钾溶液浓度的影响

由表4可知，随着氢氧化钾体积分数的增加，试样中β-胡萝卜素的含量会逐渐降低，当添加70%体积分数的氢氧化钾溶液时，胡萝卜素含量大幅下降，而不添加氢氧化钾溶液时，试样中的β-胡萝卜素的含量最高。因此，选择实验过程不添加氢氧化钾溶液，省去皂化步骤。

2.2 两种不同前处理方法对β-胡萝卜素检测结果的影响

分别采用1.2.2（省去皂化步骤）与1.2.3（包含皂化步骤）进行样品前处理，选用相同萃取溶剂（石油醚-丙酮体积比为1∶1），对固体饮料、压片糖果和软糖进行检测。由表5可知，两种前处理方法的稳定性均良好，RSD均小于5%。虽然添加了抗坏血酸，但皂化的强碱性条件和55 ℃的皂化温度使抗坏血酸加速氧化，抗氧化能力降低，从而造成皂化的检测结果与回收率均低于不皂化的检测结果。因此，针对固体饮料、压片糖果、软糖等类型β-胡萝卜素主要来源于食品添加剂的样品，不皂化的前处理方式优于现行标准中的皂化处理方式。

2.3 检测方法建立

2.3.1 标准曲线的线性及线性范围

以β-胡萝卜素标液浓度（x）作为横坐标，以峰面积（y）作为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为y=1.000 1x-0.080 6，相关系数为0.999 5，结果表明β-胡萝卜素在0.5～10.0 μg·mL-1时，线性关系良好。

2.3.2 方法精密度实验

采用1.2.2步骤前处理方式处理样品，平行测定6次，结果见表6。平行测定结果RSD均符合《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》（GB/T 27417—2017）中的精密度要求，表明方法精密度良好。

2.3.3 方法准确度实验

根据样品中β-胡萝卜素的含量，按0.5倍、1.0倍和2.0倍的量加入β-胡萝卜素标准溶液，采用不皂化前处理方法平行测定6次，计算回收率。回收率结果见表7，结果显示β-胡萝卜素的平均加标回收率在91.9%～99.3%，相对标准偏差在1.14%～3.59%，满足《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》（GB/T 27417—2017）中的对方法回收率偏差范围的要求，说明方法的准确度良好。

3 结论

对于β-胡萝卜素以游离态存在的样品，如固体饮料、糖果等，皂化处理不仅会造成样品中β-胡萝卜素含量的损失，还会延长实验时间。本文考察了不同萃取剂、不同提取温度、不同氢氧化钾浓度、不同萃取次数对测试样品中β-胡萝卜素的影响，确定了加水分散溶解、石油醚-丙酮（体积比为1∶1）萃取、水洗、浓缩后复溶用高效液相色谱法测定β-胡萝卜素的含量的方法，该方法样品加标平均回收率在91.9%～99.3%，相对标准偏差在1.14%～3.59%。该方法相较于现行国家标准《食品安全国家标准 食品中胡萝卜素的测定》（GB 5009.83—2016），更快速简便，提取效率高，结果更加准确可靠，可用于固体饮料、糖果中β-胡萝卜素的检测。