固相萃取柱净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中的五氯酚

作者: 冯淑艳 叶杉杉 张冉昊 贾爱媛 乔奇

固相萃取柱净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中的五氯酚0

摘 要:根据《食品安全国家标准 动物源性食品中五氯酚残留量的测定 液相色谱-质谱法》(GB 23200.92—2016)规定的方法对畜禽水产品中五氯酚含量进行测定,通过条件优化、质控样方法验证、不同仪器型号测试使检测条件达到最优。结果表明,以100%纯乙腈为定容液,在1~20 ng·mL-1的添加量下,五氯酚的平均回收率为84%~95%,相对标准偏差为1.72%~2.38%,该方法满足大批量畜禽水产品中五氯酚残留量的检测。

关键词:超高效液相色谱-串联四极杆质谱仪;五氯酚;动物源性食品

Determination of Pentachlorophenol in Animal-Derived Foods by Solid-Phase Extraction Column Purification-Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Abstract: According to the method specified in the GB 23200.92—2016, the content of pentachlorophenol in livestock and poultry aquatic products was determined. The detection conditions were optimized, the quality control sample method was validated, and different instrument models were tested to achieve the optimal detection conditions. The results showed that using 100% pure acetonitrile as the constant volume solution and adding from 1 ng·mL-1 to 20 ng·mL-1, the average recovery rate of pentachlorophenol was 84% to 95%, with a relative standard deviation of 1.72% to 2.38%. This method is suitable for the detection of residual pentachlorophenol in large-scale livestock and poultry aquatic products.

Keywords: ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; pentachlorophenol; animal-derived foods

五氯酚酸钠(Sodium Pentachlorophenoxide,PCP)即五氯酚钠,作为氯代烃类杀虫剂和灭真菌剂,由于其价格低廉、效果好,20世纪30年代以来,在世界范围内被广泛用于农业杀虫剂、抗菌剂和防腐剂等[1-2]。五氯酚酸钠易通过载体进入食物链并产生蓄积,如果误饮被该药污染的水或者皮肤接触被污染的水,可能会出现急性中毒,对人体的肝、肾及中枢神经系统产生损伤,临床表现为恶心、呕吐、腹泻和发力等症状,严重者则会出现呼吸加快、烦躁不安、心动过速、昏迷,甚至引起死亡等症状[3]。目前,我国除了允许在塑料、橡胶和木材的防菌剂和防腐剂中使用外,其他领域都已禁用[4-5]。2018年,刘少伟等[6]在牛肚中检测出五氯酚酸钠,提醒人们要关注食品中五氯酚酸钠的残留量。原农业部2002年235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》和中华人民共和国农业农村部公告第250号,均将五氯酚酸钠列为违禁药物,不得在动物源性食品中检出。目前,五氯酚及其钠盐的检测方法以气相色谱-质谱联用法[7-8]、液相色谱-串联质谱法[9-11]为主,其中液相色谱-串联质谱法因其定性准确,灵敏度高,前处理简单易操作,已经成为畜禽肉类及水产中五氯酚酸钠残留的主要检测方法[12-15]。近年来,随着食品抽检量加大,动物源性食品中五氯酚酸钠检出率也相对较高,尤其是动物肝脏中五氯酚酸钠的检出率偏高,含量在1.5~5.0 μg·kg-1,因此有必要建立一种回收率和准确度都满足检验要求的方法,故本文参考《食品安全国家标准 动物源性食品中五氯酚残留量的测定 液相色谱-质谱法》(GB 23200.92—2016)中对五氯酚酸钠的前处理过程,同时对标准规定的方法进行优化,使整个前处理既满足上机样品的洁净度,又能满足日常检验中回收率的要求。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

五氯酚标液(1 000 μg·mL-1),上海安谱实验科技股份有限公司;氨水(25%水溶液),天津市大茂化学试剂厂;甲醇(色谱纯),天津欧姆尼基因技术有限公司;三乙胺(色谱纯),天津市光复精细化工研究所;甲酸(色谱纯),福晨(天津)化学试剂有限公司;乙腈,天津欧姆尼基因技术有限公司;P-SAX固相萃取柱(60 mg/3 mL),Welchrom月旭科技。

API4000液相色谱-质谱/质谱联用仪,美国AB SCIEX公司;Velocity 18R Pr离心机,达美柯技术公司;超声机,德国Elma(艾尔玛)公司;氮吹仪,睿科MPE高通量真空平行浓缩仪;固相萃取仪,睿科Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪。

1.2 标准溶液配制

标准储备液(200 μg·mL-1):精确移取1 000 μg·mL-1的五氯酚标液2.0 mL,并用甲醇定容至10 mL,混匀。标准使用液(1.0 μg·mL-1):准确移取200 μg·mL-1标准储备液0.05 mL,并用甲醇定容至10 mL,混匀。

标准工作液:分别准确移取0.01 mL、0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL和0.20 mL的标准使用液,并用合适的定容液定容至10 mL,配制成浓度分别为1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1和20 ng·mL-1的标准工作曲线。

1.3 样品预处理

准确称取试样2 g于50 mL离心管中,加入5~8 mL 5%三乙胺的乙腈-水溶液。旋涡混合2 min,超声提取5 min,离心,上清液置于另一离心管中,残渣用5~8 mL 5%三乙胺的乙腈-水溶液再次提取,合并两次上清液,混匀。将提取溶液转入经过活化的阴离子固相萃取柱中,待样品溶液全部通过固相萃取柱后,弃去流出液,分别用5%氨水溶液、甲醇、2%甲酸的甲醇-水溶液淋洗,用10 mL 4%甲酸甲醇溶液洗脱,收集所有洗脱液,氮吹至近干,选择适当定容液定容至2 mL,旋涡混匀,过有机相滤膜,供液质联用仪测定。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱Waters BEH-C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流速0.3 mL·min-1;柱温40 ℃;进样量10 μL;流动相A:5 mmol·L-1乙酸铵溶液;流动相B:乙腈;洗脱梯度程序如表1所示。

1.4.2 质谱条件

选择电喷雾离子源,负离子模式(Electrospray Ionization,ESI-);检测在多反应监测(Multiple Reaction Monitoring,MRM)模式下进行;气帘气压力:10 psi;电喷雾电压:-4 500V;离子源温度:450 ℃;雾化器压力(GS1):30 psi;辅助气压力(GS2):40 psi。质谱参数如表2所示。

2 结果与分析

2.1 条件优化

2.1.1 定容液选择

在添加量在5 μg·kg-1的情况下,以牛肉、猪肉、猪肝和鲤鱼为基质,测试不同定容液下的回收率,得到结果如表3所示。可以看出五氯酚酸钠的回收率随着有机相比例的增加而提高,在纯水作为定容液时回收率很低,在甲醇或者乙腈比例占到80%时,回收率在80%~87%,而在定容液为100%甲醇或者100%乙腈时,回收率在90%~100%,尤其是纯乙腈作为定容液时,回收率接近100%。这可能是因为在过MAX固相萃取小柱时,使用5%甲酸甲醇作为洗脱液,在酸性条件下,五氯酚酸钠转变为五氯酚,五氯酚难溶于水,易溶于有机溶剂,因此选择乙腈作为本实验的定容液。

2.1.2 色谱条件优化

本文比较了水-乙腈、5 mmol·L-1乙酸铵-乙腈,5 mmol·L-1乙酸铵-甲醇、5 mmol·L-1乙酸铵(含0.1%甲酸)-乙腈4种流动相。结果发现,5 mmol·L-1乙酸铵-乙腈,5 mmol·L-1乙酸铵-甲醇和水-乙腈作为流动相时,峰形较差,响应偏低,由于五氯酚为强极性化合物,在C18色谱柱上保留较差,所以最终选择5 mmol·L-1乙酸铵(含0.1%甲酸)-乙腈作为流动相,可以保证五氯酚的峰形较好,响应较强。

2.2 质控样方法验证

以冻干鱼粉为质控样,测试该方法的可行性。准确称取1.25 g鱼肉冻干粉,加入3.75 g水进行复原,按照1.3进行样品预处理,100%乙腈作为定容液,最终结果如图1所示。冻干鱼粉中五氯酚添加量为44.2 μg·kg-1,而通过实验测试所得结果为44.0 μg·kg-1,回收率接近100%,说明以100%乙腈作为定容液,五氯酚酸钠的回收率更为理想,完全满足检验要求。

2.3 不同仪器型号测试

在超高效液相色谱仪品牌型号的选择方面,以乙腈作为复溶液上机测试,加标量为5 μg·kg-1的牛肉样品质谱图见图2。通过两组质谱图可以看出,两种品牌型号的设备上响应和峰形都满足检验要求。

2.4 基质效应

为了测试基质效应,利用鲤鱼、猪肉、牛肉和猪肝样品制作基质加标样品,按照相同的仪器参数进行分析,质谱图见图3。通过比较发现,猪肉的基质效应最大,在五氯酚酸钠的保留时间处基线相对更为杂乱,需要在定性时注意4对离子对的离子丰度比。

2.5 方法建立

2.5.1 线性范围、检出限和定量限

以五氯酚酸钠标准溶液浓度(x)为横轴,以定量离子峰面积(y)为纵轴,绘制标准曲线。线性方程为y=5.13×104x+3.15×104,表明五氯酚酸钠质量浓度在1~20 ng·mL-1的线性关系良好,R2>0.999。

2.5.2 准确度和精密度

在空白牛肉中,考察不同添加量(1 μg·kg-1、

2 μg·kg-1、5 μg·kg-1)下的五氯酚酸钠回收率。由表4可知,平均回收率为84%~95%,相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)为1.72%~2.38%,说明该方法完全满足检验要求。

3 结论

本方法参考《食品安全国家标准 动物源性食品中五氯酚残留量的测定 液相色谱-质谱法》(GB 23200.92—2016)中对五氯酚的前处理过程,验证不同定容液对于五氯酚回收率的影响,结果表明在畜肉及水产品检测时,定容液中有机相比例越高五氯酚的回收率越高,特别是以纯乙腈作为定容液,回收率接近100%。以鱼肉冻干粉质控样作为测试样品,结果回收率可到100%,证明测试方法可行性。同时,利用空白牛肉作为基质分别测试了准确度和精密度,证明该方法满足检验要求,适合作为五氯酚的检验分析。

参考文献

[1]CROSBY D G.Environmental chemistry of pentachlorophenol[J].Pure and Applied Chemistry,1981,53(5):1051-1080.

经典小说推荐

杂志订阅

友情链接