乳制品中AFT M1和AFT M2的系统适应性试验的验证

摘 要：为了准确测定黄曲霉毒素M1（AFT M1）和黄曲霉毒素M2（AFT M2）的含量，本文采用高效液相色谱法对AFT M1和AFT M2的系统适应性试验进行了验证。在0～5 ng·mL-1，AFT M1和AFT M2均呈现良好的线性关系。免疫亲和柱的验证、方法检出限和定量限均符合GB 5009.24—2016规定，AFT M1和AFT M2的回收率符合GB/T 27404—2008规定。使用该方法对9个乳制品进行了测定，发现样品中AFT M1和AFT M2可准确测得。

关键词：黄曲霉毒素；高效液相色谱法；免疫亲和柱；系统适应性试验

Validation the System Suitability Test of AFT M1 and AFT M2 in Dairy Products

NIU Lili

（Changzhi Comprehensive Inspection and Testing Center， Changzhi 046000， China）

Abstract： In order to determine the content of aflatoxin M1 （AFT M1） and aflatoxin M2 （AFT M2） accurately， the system suitability test of AFT M1 and AFT M2 was verified by high performance liquid chromatography. AFT M1 and AFT M2 show a good linear relationship within the range of 0～5 ng·mL-1. The verification test and the method detection limit and quantitative limit of the immunoaffinity column are in accordance with the provisions of GB 5009.24—2016. The average recovery rate of AFT M1 and AFT M2， which is in accordance with the provisions of GB/T 27404—2008. Nine dairy products were measured by this method， and the results showed that AFT M1 and AFT M2 in the samples could be accurately measured.

Keywords： aflatoxin; high performance liquid chromatography; immunoaffinity column; system suitability test

黄曲霉毒素俗称霉菌毒素，是由不同黄曲霉寄生曲霉产生的次生代谢产物[1]，由于黄曲霉毒素具有强致癌性，国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer，IARC）将其列为Ⅰ类致癌物。到目前为止，已经发现20多种黄曲霉毒素，主要有黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2 6种。其中，黄曲霉毒素M1（AFT M1）和黄曲霉毒素M2 （AFT M2）是黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2在肝微粒体细胞色素P450作用下生成的羟基化代谢物[2]。

本文主要对新修订的标准GB 5009.24—2016[3]中液相色谱法的系统适应性试验进行了验证，确保本检验检测机构能够准确对乳制品中AFT M1和AFT M2进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灭菌乳、发酵乳、乳粉均购自长治市金威超市；AFT M1和AFT M2溶液标准物质，阿杰泰克公司；乙腈、甲醇均为色谱纯，美国马自达公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

LC-20A高效液相色谱仪（荧光检测器），岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

样品提取按照GB 5009.24—2016中12.1进行操作；样品净化按照免疫亲和柱说明书进行操作。

1.3.2 标准溶液的制备

分别准确吸取AFT M1和AFT M2溶液标准物质各1 mL，共置于100 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，即得100 ng·mL-1混合标准使用液。分别精密量取上述混合标准使用液25 μL、50 μL、50 μL、100 μL、500 μL、100 μL、200 μL和500 μL，各置于250 mL、250 mL、100 mL、100 mL、100 mL、10 mL、10 mL和10 mL容量瓶中，用初始流动相稀释至刻度，摇匀。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：C18柱；流动相：A相为水，B相为乙腈-甲醇（50+50）；等梯度洗脱条件：A 70%，B 30%；流速：1.0 mL·min-1；柱温：40 ℃；波长：激发波长360 nm，发射波长430 nm；进样量：50 μL。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的线性和工作范围

按1.3.2中的操作进行测定，以AFT M1 和 AFT M2的浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线。在0～5 ng·mL-1呈现良好的线性关系，AFT M1 的线性方程为y=3 582 690x+15 840.9，r=0.999 8，AFT M2 的线性方程为y=6 777 570x+

32 434.1，r=0.999 9，符合GB/T 27404—2008[4]中验证方法相关系数不应低于0.99的规定。

2.2 柱容量、柱回收率、交叉反应率验证

每个批次的免疫亲和柱在使用前均需进行质量验证，包括柱容量、柱回收率以及交叉反应率的验证。按GB 5009.24—2016规定的操作进行测定，得到同一批次3根免疫亲和柱的AFT M1含量（111.3 ng、109.2 ng、111.0 ng）和AFT M2含量（105.6 ng、104.6 ng、105.4 ng）均＞80 ng，说明该免疫亲和柱符合同时测定样品中AFT M1和AFT M2含量的使用要求。

2.3 方法检出限和定量限

按照GB 5009.24—2016对灭菌乳和乳粉的检出限和定量限进行测定。由表1可以得到，灭菌乳和乳粉的检出限信噪比均大于3，定量限的信噪比均大于10，满足试验测定要求。

2.4 回收率

从表2中可以看出，样品中AFT M1添加浓度在0.012 5～0.500 0 μg·kg-1，平均回收率为89%～94%，准确度良好；同时做3水平6平行实验，RSD为2.8%～7.7%，重复性良好。

从表3中可以看出，样品中AFT M2添加浓度在0.006 25～0.500 00 μg·kg-1，平均回收率为79%～87%，准确度良好；同时做3水平6平行实验，RSD为1.8%～7.7%，重复性良好。回收率和RSD均满足GB/T 27404—2008对验证试验的要求。

2.5 不同样品中AFT M1和AFT M2的测定

分别对灭菌乳、发酵乳、乳粉各3种进行测定，所有样品中的AFT M1和AFT M2均未检出（含量均低于方法检出限）。从侧面说明了乳制品市场的稳定性，同时为广大消费者提供了参考。

3 结论

不同动物以牛奶中的AFT M1 含量最高[5]，同时各种乳制品又是深受广大消费者喜爱的一类食品，考虑到黄曲霉毒素的强致癌性，GB 2761—2017[6]规定了乳制品中AFT M1的限量为0.5 μg·kg-1。食品新项目扩项工作要求满足检测标准GB/T 27404—2008项下的要求，本文通过对新修订的标准GB 5009.24—2016中液相色谱法的系统适应性试验方法进行了验证，在本检验机构检验条件下，测得该方法具有良好的准确度、精密度和重复性。在0～5 ng·mL-1AFT M1 和AFT M2均呈现良好的线性关系。柱验证试验证明该免疫亲和柱符合同时测定样品中AFT M1 和AFT M2含量的使用要求。方法检出限、定量限、回收率的研究也表明实验室满足定量检测AFT M1 和AFT M2含量的要求。通过对9个乳制品进行测定发现，样品均未受到AFT M1和AFT M2的污染。

参考文献

[1]赵贞，万鹏，李翠枝，等.乳与乳制品中黄曲霉毒素检测方法和限量标准研究[J].饮料工业，2019，22（2）：72-76.

[2]刘云花，邓敬，毛建霏，等.免疫亲和层析净化-超高效液相色谱法测定生鲜牦牛乳中黄曲霉毒素M1及M2[J].食品与发酵科技，2019，55（1）：114-118.

[3]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M族的测定：GB 5009.24—2016[S].北京：中国标准出版社，2016.

[4]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.实验室质量控制规范 食品理化检测：GB/T 27404—2008[S].北京：中国标准出版社，2008.

[5]梁江，宋筱瑜，李凤琴.黄曲霉毒素M1研究进展[J].卫生研究，2013，42（6）：1055-1059.

[6]国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量：GB 2761—2017[S].北京：中国标准出版社，2017.