不同因素对板栗保藏中氧化的影响

摘 要：板栗在贮藏过程中易发生氧化，氧化会对板栗的贮藏、运输、销售产生不利影响，控制氧化可以有效延缓板栗的褐变速度。本文以信阳板栗为原料，探究不同温度、pH值、底物浓度对板栗中多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）活性和丙二醛含量的影响，为板栗的贮藏保鲜提供理论依据。结果表明，PPO的最适反应条件为温度30 ℃，底物浓度0.10 mol·L-1；pH=9时，PPO活性几乎全部丧失，说明碱性环境比酸性环境对PPO活性的影响大；当褐变指数为0.2时，丙二醛含量较低，褐变指数为0.8时，丙二醛含量较高，为2.38 µmol·L-1。

关键词：板栗；多酚氧化酶；丙二醛；褐变

Effects of Different Factors on Oxidation of Chestnut

in Storage

LIU Shujing， WEI Yanshu， YANG Ruyi， CAO Meng， LI Jianfang*

（Food College Xinyang Agriculture and Forestry College， Xinyang 464000， China）

Abstract： Chestnut is prone to oxidation in the storage process， which will have adverse effects on the storage， transportation and sales of chestnut. Controlling oxidation can effectively slow the browning rate of chestnut. This paper explores the influence of different temperature， pH value and substrate concentration on the polyphenol oxidase （PPO） activity and malondialdehyde content in Chinese chestnut， which provides a theoretical basis for the storage and preservation of Chinese chestnut. The results show that the optimal reaction condition of PPO is 30 ℃， substrate concentration is 0.10 mol·L-1; at pH=9， PPO activity is almost completely lost， indicating that alkaline environment has more influence on PPO activity than acidic environment; when the browning index is 0.2， malondialdehyde content is low， and when browning index is 0.8， malondialdehyde content is 2.38 µmol·L-1.

Keywords： chestnuts; polyphenol oxidase; malondialdehyde; browning

板栗是我国食用最早的坚果之一，年产量居世界首位，品种繁多。目前，板栗以鲜果和初加工为主，但是病虫害、内腐病、褐变等问题严重影响了板栗的产量及其深加工产业的发展。研究表明，多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）是引起板栗褐变的主要因素[1]。多酚氧化酶也称酪氨酸酶，能催化多酚类化合物的氧化反应，形成颜色较深的多酚化合物，导致板栗颜色变暗。在板栗中，多酚氧化酶的活性与褐变有着密切的关系，多酚氧化酶的活性越高，果实的褐变越快，如果减弱或抑制多酚氧化酶的活性，就能延缓果实的褐变速度，影响多酚氧化酶活性的主要因素有温度、pH值、底物浓度。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花板栗：无病虫害、无机械损伤的新鲜信阳板栗；磷酸缓冲液：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；邻苯二酚：上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

XMTD-204数显恒温水浴锅：上海梅香仪器有限公司；GTR16-2医用离心机：北京新时代北利医疗器械有限公司；CP214电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；A390紫外可见分光光度计：翱艺仪器（上海）有限公司；BC/BD-200HEP电冰柜：青岛海尔特种电冰柜有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 粗酶液的提取

参考饶先军等[2]提取结球生菜中多酚氧化酶的方法，做适当修改。取鲜板栗剥壳去衣，清水清洗后用干净纸巾擦干表面水分，称取5 g不同部位的板栗，切碎混匀放入研钵中，加入少量石英砂和10 mL pH=7.0的0.05 mol·L-1的预冷磷酸缓冲液进行冰浴研磨，研磨成匀浆后移到20管 1.5 mL离心管中，在4 ℃，12 000 r·min-1条件下冷冻离心15 min，取上清液，在4 ℃冰柜中保存备用。

1.3.2 邻苯二酚溶液的配制

称取0.11 g的邻苯二酚于烧杯中，加少量纯水，用玻璃棒捣研溶解，用玻璃棒引流进100 mL棕色容量瓶中，再用纯水冲洗玻璃棒和烧杯3次，将冲洗后的液体引流进容量瓶中，用纯水定容，摇匀，得到0.01 mol·L-1的邻苯二酚溶液。分别称取0.22 g、0.33 g、0.44 g、0.55 g、0.66 g、0.77 g、0.88 g，0.99 g和1.10 g的邻苯二酚，用上述方法配制成0.02 mol·L-1、0.03 mol·L-1、0.04 mol·L-1、0.05 mol·L-1、0.06 mol·L-1、0.07 mol·L-1、0.08 mol·L-1、0.09 mol·L-1和0.10 mol·L-1的邻苯二酚溶液，配制完后贴好标签，放置于阴凉避光处备用。

1.3.3 酶活性测定

取1.5 mL一定pH值的磷酸缓冲液和1.0 mL一定浓度的邻苯二酚溶液于试管中，再加入0.5 mL酶液，水浴保温3 min后立即用紫外分光度计测量吸光度并计时，在波长410 nm下每隔0.5 min进行吸光度测定，记录以备计算，共记录3 min。以每分钟内吸光度增加0.001为1个活性单位U，酶活性可以表示为U·min-1。用在沸水中加热5 min的酶液为对照，做3组重复实验，取平均值作为测得的PPO活性。

1.3.4 温度和底物浓度试验

采用双因素试验[3]，分别在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃条件下让浓度为0.01 mol·L-1、0.02 mol·L-1、0.03 mol·L-1、0.04 mol·L-1、0.05 mol·L-1、0.06 mol·L-1、0.07 mol·L-1、0.08 mol·L-1、0.09 mol·L-1和0.10 mol·L-1的邻苯二酚溶液与PPO粗酶液反应。取1.5 mL的pH=7的磷酸缓冲液和1.0 mL不同浓度的邻苯二酚溶液于试管中，再加入0.5 mL酶液，混匀后在不同温度下保温3 min，立即在410 nm下测定吸光度变化值。

1.3.5 pH值试验

取1.5 mL的pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的磷酸缓冲液，分别加入1.0 mL浓度为0.05 mol·L-1的邻苯二酚溶液，加入0.5 mL酶液后30 ℃保温，迅速倒入比色皿中测吸光度变化值。

1.3.6 褐变指数测定

褐变指数=∑（各褐变级别分值×各级褐变面积百分数）/（褐变最高级别分值×100%），式中各级褐变面积用透明厘米方格纸测定，褐变级别分值按板栗果仁颗粒（直径在1.0～2.0 mm）褐变颜色深度评判，具体评分标准见表1。

1.3.7 丙二醛含量测定

采用硫代巴比妥酸法测定，从10个板栗果实中称取样品2.0 g，加入10.0 mL预冷过的100 g·L-1三氯乙酸溶液研磨成匀浆，将匀浆液4 ℃、12 000 r·min-1离心20 min，收集上清液，低温保存备用。取

2.0 mL上清液，对照管中加2.0 mL 100 g·L-1的三氯乙酸溶液，加入2.0 mL 0.67%的硫代巴比妥酸溶液，混合，煮沸20 min，取出冷却，如有沉淀需再离心，取上清液分别测定反应液在波长450 nm、532 nm、600 nm的吸光度，重复3次。根据溶液吸光度计算出反应混合液中丙二醛含量，按公式计算出每克样品中丙二醛含量。

1.4 数据处理

除特殊说明外，所有数据平行测定3次，用Excel 2010进行数据处理，计算标准偏差，采用Origin 9软件处理数据和作图。

2 结果与分析

2.1 不同温度对PPO活性的影响

如表2所示，PPO活性在30 ℃时高，在35 ℃、40 ℃的活性次之，在20 ℃时活性最低。温度对酶活性影响很大，低温有助于抑制PPO的酶活性，且低温相较于高温对PPO活性的抑制效果更好。王磊等[4]的研究表明在95 ℃，5 min左右就会几乎完全抑制PPO活性。高温虽能更好地抑制酶活性，但是对于板栗的贮运和鲜销是不利的，所以对于板栗的保鲜采用低温冷藏较好。

2.2 底物浓度对PPO活性的影响

如表2所示，在不同的温度下，随着底物浓度的升高，PPO活性呈现出逐渐上升的趋势，本实验PPO的最适反应条件是30 ℃，底物浓度0.10 mol·L-1。

30 ℃时，随着底物浓度的升高，PPO活性增加的速率先增大再减小，说明温度适宜时，在一定范围内，板栗果实中的多酚类物质越多，板栗果实就越容易褐变。

2.3 不同pH值对PPO活性的影响

如图1所示，当pH值为4～6时，PPO活性逐渐升高，pH=6时PPO活性最高，pH值为7～9时，酶液处于碱性环境，PPO活性迅速下降，pH=9时，PPO活性几乎全部丧失。碱性环境比酸性环境对PPO活性的影响大，与王磊等[4]、郑龙等[5]的研究结果一致。

2.4 褐变指数对丙二醛含量的影响

由图2可知，随着褐变指数的增加，板栗中丙二醛的含量总体呈上升趋势，说明板栗在贮藏过程中脂肪的氧化程度升高。当褐变指数在0.2时，丙二醛含量较低。褐变指数为0.8时，丙二醛含量较高，为2.38 µmol·L-1。

3 结论

本实验以信阳板栗为原料，研究温度、pH值、底物浓度对板栗中多酚氧化酶活性和丙二醛含量的影响。实验结果表明温度对酶活性影响很大，低温能更好地抑制多酚氧化酶的活性；碱性环境能更好地抑制多酚氧化酶的活性，pH=9时效果最佳；当褐变指数为0.2时，丙二醛含量较低，褐变指数为0.8时，丙二醛含量较高，为2.38 µmol·L-1。本次研究发现适当控制温度、pH值、底物浓度，能很好地抑制多酚氧化酶的活性，提高板栗品质。

参考文献

[1]周丹，李颖佳，王建中，等.板栗酶促褐变过程中多酚氧化酶和过氧化物酶活性的变化[J].食品科技，2014，39（6）：47-50.

[2]孙丽华，郭建华，刘乃侨.大麦萌发过程中过氧化物酶酶学特性初探[J].辽宁经济职业技术学院（辽宁经济管理干部学院学报），2009（6）：64-65.

[3]饶先军，刘升，王则金，等.结球生菜多酚氧化酶动力学特性研究[J].食品工业科技，2022，32（9）：80-82.

[4]王磊，兰玉倩，赵倩辉，等.板栗仁多酚氧化酶特性研究[J].中国食品添加剂，2010（5）：93-97.

[5]郑龙，肖正东，王陆军，等.板栗品种褐变度差异性及其多酚氧化酶活性的相关性研究[J].食品工业科技，2015，36（18）：126-130.