高效液相色谱检测葡萄及葡萄酒中7种有机酸方法的建立

摘 要：目的：建立了利用高效液相色谱测定葡萄及葡萄酒中7种有机酸的检测方法。方法：色谱条件为Hi-Plex H色谱柱（300 mm×7.7 mm，8 μm），PL Hi-Plex H保护柱（50 mm×7.7 mm，8 μm）；紫外检测波长210 nm；流动相为0.006 mol·L-1的硫酸；流速0.6 mL·min-1；柱温55 ℃；进样量10 μL。结果：草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸和乙酸出峰时间均在20 min以内；标准曲线线性关系良好，相关系数（R2）在0.999 9～1.000 0；检出限在0.031 4～0.722 3 mg·L-1；加标回收率在95.24%～102.04%，其相对标准偏差在0.16%～1.87%。结论：该方法操作简单，检测时间短，具有较高的准确性和精确性。

关键词：有机酸；葡萄；葡萄酒；高效液相色谱；检测方法

Establishment the Method of Seven Kinds of Organic Acids in Grape and Wine by High Performance Liquid Chromatography

SHEN Yan1， ZHANG Zhengwen1， LIU Xingkai1， WANG Fucheng2， SHAO Xuedong1*

（1.Junding Castle Co.， Ltd.， Yantai 265607， China; 2.Yantai Penglai District Grape and Wine Industry Development Service Center， Yantai 265699， China）

Abstract： Objective： To establish a HPLC method for the determination of 7 organic acids in grape and wine. Method： The chromatographic conditions were Hi-Plex H column （300 mm×7.7 mm， 8 μm） and PL Hi-Plex H protective column （50 mm×7.7 mm， 8 μm）. UV detection wavelength 210 nm; sulfuric acid with 0.006 mol·L-1 mobile phase; flow rate 0.6 mL·min-1; column temperature 55 ℃. The sample size was 10 μL. Result： The peak time of oxalic acid， citric acid， tartaric acid， malic acid， succinic acid， lactic acid and acetic acid were all within 20 min. The standard curve has a good linear relationship with the correlation coefficient（R2） ranging from 0.999 9 to 1.000 0. The detection limit was 0.031 4～0.722 3 mg·L-1. The recoveries ranged from 95.24% to 102.04%， and the relative standard deviations ranged from 0.16% to 1.87%. Conclusion： The method is simple to operate， short detection time， and has high accuracy and accuracy.

Keywords： organic acid; grape; wine; high performance liquid chromatography; detection method

有机酸是葡萄果实及葡萄酒中体现风味的主要物质之一，其含量是衡量葡萄果实成熟度和品质的重要参数，在葡萄酒的酿造中发挥着关键作用，对酒的感官质量有一定的影响，与酒的物理化学以及微生物稳定性有着紧密联系[1-4]。酒石酸、苹果酸、柠檬酸和琥珀酸等有机酸普遍存在于葡萄果实以及葡萄酒中，具有各自的特点及功效[4-5]。此外，有机酸含量的高低会直接影响葡萄酒的酸碱平衡与整体的口感风味[6-7]。

近年来，采用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）测定葡萄及葡萄酒中有机酸的方法有很多，相较于气相色谱、离子色谱以及其他的传统检测方法，HPLC具有对样品要求低、操作简单、检测时间短、结果准确、重复性好以及可同时检测多种有机酸等优点，应用广泛[8]。液相设备和色谱柱型号不同，检测条件及方法也不尽相同，导致有机酸检测结果有差异。本研究拟用HPLC法，在前人研究的基础上，对检测条件进行优化，形成一套检测葡萄及葡萄酒中有机酸的完整体系，为葡萄酒企业提供良好的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄及葡萄酒样品，君顶酒庄有限公司；纯净水，娃哈哈宏振食品饮料贸易有限公司；浓硫酸（分析纯），山东莱阳经济技术开发区精细化工厂；酒石酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸、草酸、乳酸和乙酸（标准品），英国政府检测标准集团。

1.2 仪器与设备

1260 Infinity II高效液相色谱仪；G7114A1260 VWD检测器；Hi-Plex H色谱柱（300 mm×7.7 mm，8 μm）；PL Hi-Plex H保护柱（50 mm×7.7 mm，8 μm），美国Agilent公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；HC-3016R高速冷冻离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 试样处理

取5 mL葡萄汁或葡萄酒于离心管中，在14 000 r·min-1、4 ℃下离心20 min，抽取上清液，用0.45 μm膜过滤，将滤液置于进样小瓶中待测。

1.3.2 标准品处理

有机酸混合标准品配制前，将标准品分别注入仪器中，以确认各有机酸出峰顺序及预计保留时间。混合标准品母液配制：酒石酸4 000 mg·L-1、苹果酸4 060 mg·L-1、柠檬酸4 060 mg·L-1、乳酸4 100 mg·L-1、草酸2 020 mg·L-1、琥珀酸2 140 mg·L-1、乙酸2 100 mg·L-1，按照实验要求稀释到不同浓度梯度备用。

1.3.3 高效液相色谱条件

色谱柱：Hi-Plex H（300 mm×7.7 mm，8 μm）；波长：205～215 nm；流动相：0.004～0.008 mol·L-1硫酸水溶液；流速：0.4～0.8 mL·min-1；柱温箱温度：40～60 ℃；有机酸进样量：5～15 μL。

2 结果与分析

2.1 HPLC检测有机酸条件优化

2.1.1 波长的选择

根据马永强等[8]的研究，在波长205～215 nm下进行有机酸的检测。结果表明，在210 nm波长下，7种有机酸的响应值最高。

2.1.2 流动相的选择

根据色谱柱使用要求及郭燕等[9]的研究，比较0.004 mol·L-1、0.005 mol·L-1、0.006 mol·L-1、0.007 mol·L-1和0.008 mol·L-1的硫酸作为流动相的分离效果。结果表明，低浓度下（0.006 mol·L-1浓度以下），柠檬酸与酒石酸分离效果较差；高浓度下（0.006 mol·L-1浓度以上），整体分离效果都差。因此，选择0.006 mol·L-1的硫酸作流动相。

2.1.3 流速的选择

根据丁玲等[10]的研究，在0.4 mL·min-1、0.5 mL·min-1、0.6 mL·min-1、0.7 mL·min-1和0.8 mL·min-1流速下检测有机酸。在低流速下，草酸的峰出现了拖尾的现象，且检测时间长，全部出峰所需时间约40 min；在高流速下，柱压过高，可达48 MPa，而色谱柱最高压力要求为50 MPa。因此，确定流速为0.6 mL·min-1。

2.1.4 柱温的选择

根据张军等[11]的研究，选择在柱温为40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃下对有机酸进行检测。当柱温较低时，柠檬酸与酒石酸的分离度过低，随着柱温的升高，二者分离度逐渐增大。60 ℃为Hi-Plex H色谱柱的最高使用温度，因此为了柱效以及长期检测效果，确定检测柱温为55 ℃。

2.1.5 进样量的选择

根据丁青芝等[12]的研究，选择进样量为5 μL、10 μL、15 μL检测有机酸，当进样量为5 μL时，各有机酸的响应值相对较低，当进样量为15 μL时，柠檬酸与酒石酸的分离度不到1.5。因此，确定进样量为10 μL。

综上所述，HPLC检测有机酸的最佳色谱条件为紫外检测波长210 nm；流动相0.006 mol·L-1硫酸；流速0.6 mL·min-1；柱温55 ℃；进样量10 μL。

2.2 方法学研究

2.2.1 标准曲线的绘制

根据上述优化得到的色谱条件，将不同浓度梯度的有机酸混合标准品进样，得出7种有机酸的色谱图，见图1。出峰时间在20 min内，分离度均大于1.5。用峰面积（y）与质量浓度（x，mg·L-1）绘制7种有机酸标准曲线，见表1。

由表1可知，7种有机酸的峰面积和浓度的相关系数（R2）都在0.999 9～1.000 0，说明在相应的浓度范围内线性关系良好；各有机酸的最低检出限在0.031 4～0.722 3 mg·L-1（信噪比（S/N≥3），说明该方法的灵敏度较高。

2.2.2 加标回收率

取一葡萄酒样品，添加3种不同浓度的有机酸标准品，重复检测6次，结果见表2。各有机酸加标回收率在95.24%～102.04%，相对标准偏差在0.16%～1.87%，表明该方法的准确性良好。

2.3 HPLC检测有机酸方法的精密度

2.3.1 有机酸保留时间的重现性

取一葡萄酒样品，重复检测6次，测定各有机酸的保留时间，结果见表3，各有机酸保留时间的标准偏差在0.005～0.073 min，相对标准偏差在0.029%～0.811%，说明在该条件下，有机酸保留时间具有良好的重现性。

2.3.2 有机酸含量的重现性

取一葡萄酒样品，重复检测6次，测定各有机酸的平均含量，结果见表4。各有机酸含量的标准偏差在3.024～11.430 mg·L-1，相对标准偏差在0.388%～3.426%，表明该方法重现性较好。

3 结论

本研究确定了HPLC检测葡萄以及葡萄酒中草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸和乙酸等7种有机酸的方法，最佳色谱条件如下。色谱柱为Hi-Plex H；紫外检测波长为210 nm；流动相为0.006 mol·L-1的硫酸；流速为0.6 mL·min-1；柱温为55 ℃；进样量为10 μL。该方法样品前处理简便、检测时间短、灵敏度高、精确性及准确性好，适用于葡萄及葡萄酒中有机酸的快速检测。

参考文献

[1]李华，王华.葡萄酒酿造与质量控制手册[M].咸阳：西北农林科技大学出版社，2017.

[2]朱磊，陈芸华，胡禧熙，等.葡萄有机酸的研究进展[J].中外葡萄与葡萄酒，2022（6）：88-95.

[3]杨春霞，苟春林，单巧玲.葡萄酒酿造过程中有机酸变化规律研究[J].中国酿造，2017，36（4）：83-86.

[4]于静，孙娅娜，孙翔宇，等.基于有机酸高效液相色谱的葡萄酒品质分析[J].农业机械学报，2017，48（12）：354-362.

[5]牛生洋，刘崇怀，刘强，等.葡萄种质果实有机酸组分及其含量特性[J].食品科学，2022，43（12）：228-234.

[6]裴英豪，王云霞，李浩浩，等.‘赤霞珠’葡萄果实中有机酸的积累规律[J].安徽农学通报，2020，26（21）：19-20.

[7]王晶，万智博，许超丽，等.新疆产区酿酒葡萄果实中有机酸的比较分析[J].现代食品科技，2020，36（2）：249-254.

[8]马永强，邓倩，范洪臣，等.高效液相色谱法测定发酵液中有机酸的优化研究[J].中国调味品，2019，44（10）：18-25.

[9]郭燕，梁俊，李敏敏，等.高效液相色谱法测定苹果果实中的有机酸[J].食品科学，2012，33（2）：227-230.

[10]丁玲，屠幼英，陈晓敏.高效液相色谱测定紧压茶中有机酸条件研究[J].茶叶，2005（4）：224-227.

[11]张军，韩英素，高年发，等.HPLC法测定葡萄酒中有机酸的色谱条件研究[J].酿酒科技，2004（2）：91-93.

[12]丁青芝，谷耀光，周艺诗，等.蜂胶葡萄酒中8种有机酸RP-HPLC分析方法的建立[J].食品工业，2014，35（12）：279-283.