液相色谱-串联质谱法测定猪肝中沙罗拉纳的残留量及方法耐用性研究
作者: 夏玉吉 陈华凤 窦明理 武首薰 何楠 王毅
摘 要:目的:建立了液相色谱-串联质谱法测定猪肝中沙罗拉纳残留量的测定方法,并对方法耐用性进行了研究,旨在找出对检测结果有重大影响的因素。方法:检测方法对样品前处理、色谱条件等环节进行了考察,样品经乙腈超声提取,PRiME HLB固相萃取小柱净化,净化液氮吹近干,甲醇复溶,过膜,滤液供液相色谱-串联质谱测定;采用国际化学家协会编制的《AOAC分析方法手册》中推荐的方法,考察了测定过程中不能刻意控制的10个微小因素对检测结果准确度的影响,分别以各影响因素两个水平的差值来表示影响的大小。结果:本次测试了猪肝中沙罗拉纳的残留量,其在0~200 ng·mL-1线性关系良好,y=22.09x+28.32,r2=0.999;耐用性试验结果表明,检测时间的差值较大,其余影响因素的差别不明显,分别运用t检验、各因素差值与标准差比较两种统计方法对耐用性实验结果进行评价,两种方法的评价结果基本一致,对检测结果准确度影响最大的是检测时间,实际检测工作中应及时测试处理好的样品,减少因长时间放置对检测结果的影响。结论:该检测方法操作过程简单,检测速度快,选择性强,灵敏度高,可作为猪肝中沙罗拉纳残留量的检测方法;耐用性试验为检测方法开展协同试验提供了技术支撑。
关键词:沙罗拉纳;测定;耐用性试验;微小因素
Study of the Robustness and Determination of Residues of Sarolaner in Porcine Liver by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
XIA Yuji1,2, CHEN Huafeng1,2, DOU Mingli1,2, WU Shouxun3, HE Nan1,2, WANG Yi1,2*
(1.Sichuan Institute of Food Inspection, Chengdu 610097, China; 2.Key Laboratory of Baijiu Supervising Technology for State Market Regulation, Chengdu 610097, China; 3.Sichuan University, Chengdu 610000, China)
Abstract: A method for the determination of residue of sarolaner in porcine liver by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS) was established, and the robustness of the method was studied, in order to find out the factors that have a significant impact on the detection results. Method: The detection method investigated the sample preparation and chromatographic conditions. The samples were extracted by acetonitrile ultrasound, PRiME HLB solid phase extraction cartridge purification, purified liquid nitrogen blowing near drying, methanol reconstitution, membrane, filtrate for LC-MS. Using the method recommended in statistical manual of the AOAC Analysis Method Manual. The influence of 10 tiny factors that could not be deliberately controlled on the accuracy of the test results was investigated. The influence was expressed by the difference of two levels of each influencing factor. Result: The residual amount of sarolane in pig liver was tested this time, and its linear relationship was good within 0~200 ng·mL-1, y=22.09x+28.32, r2=0.999; The robustness test results show that the difference of detection time was large, and the difference of other influencing factors was not obvious. The two statistical methods of t-test and the comparison between the difference of each factor and the standard deviation are respectively used to evaluate the durability test results. The evaluation results of the two methods are basically the same. The biggest impact on the accuracy of the test results is the test time. In the actual test work, the processed samples should be tested in time to reduce the impact on the test results due to long-time storage. Conclusion: The results show that the detection method is simple in operation, fast in detection speed, strong in selectivity and high in sensitivity, and can be used as a detection method for sarolaner residue in porcine liver.
Keywords: sarolaner; mensuration; robustness test; tiny factor
兽药残留是目前食品安全监管的重要内容,液相色谱-串联质谱法灵敏度高,能够快速识别动物源性食品中的兽药残留,已广泛应用于食品安全监管。沙罗拉纳[1]是一类作用于γ-氨基丁酸受体的新型驱虫药[2],与其他驱虫药相比,这类药物具有吸收迅速、作用时间长(可持续12周)[3]、代谢率低的特点(半衰期为10~14 d[4]),容易在肉及肉制品中残留。肝脏是这类药物的主要代谢器官,且肝脏基质复杂,常规净化效果不佳,因此选择肝脏作为代表基质研究样品的前处理,建立液相色谱-串联质谱分析方法,并对方法的耐用性进行考察。
分析方法的耐用性是指分析方法对实验室一般不易控制或不能保持完全一致的微小条件变化的敏感性[5]。《化学分析方法验证确认和内部质量控制 术语和定义》(GB/T 32467—2015)和《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》(GB/T 27417—2017)都对分析方法建立时开展耐用性试验有严格的要求,但这些标准中并未给出具体的试验方案,仅有的几篇文献也只报道了耐用性试验在重金属检测[6-8]以及气相色谱测定环境污染物等领域的应用,未见耐用性试验在液相色谱-串联质谱分析领域的报道。本试验首先建立沙罗拉纳的液相色谱-串联质谱分析方法,再以W.J.尤登教授的耐用性试验为基础,利用PASW Statistics 18软件设计正交表,考察10个微小影响因素对试验结果的影响,再运用t检验、因素差值与标准差比较等两种统计方法对耐用性试验结果进行评价。研究结果将为液相色谱-串联质谱领域开展耐用性试验的因素选择、方案设计提供参考。
1 试验部分
1.1 仪器与试剂
安捷伦1290/6460液相色谱-串联质谱仪,电子天平XS105DU,高速离心机HERAEUS MULTIFUGE X3R,涡旋混合仪 IKA MS 3。
沙罗拉纳标准品,浓度为100 μg·mL-1;甲醇、乙
腈、甲酸铵均为色谱纯;PRiME HLB固相萃取柱150 mg/3 mL;阴性猪肝样品。
1.2 色谱条件
色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse plus C18(100 mm×
2.1 mm,1.8 μm),流动相A为5 mmol·L-1甲酸铵水,流动相B为甲醇,洗脱程序梯度为0~
2.0 min,体积分数为70%的甲醇;5.0~7.0 min,体积分数为90%的甲醇;7.1~10.0 min,体积分数为70%的甲醇,流速为0.3 mL·min-1,柱温为30 ℃,进样体积为2 μL。
质谱参数如下。大气压电喷雾离子源(API-ESI);MRM 模式;干燥气温度:350 ℃; 干燥气流量:
5 L·min-1;雾化气压力:45 psi;鞘气温度:300 ℃;鞘气流量:11 L·min-1;毛细管电压:3.5 kV;喷嘴电
压:500 V;增益电压:300 V。MRM 测定参数为正模式,母离子(m/z)581,定量离子(m/z)444,定性离子(m/z)416,去簇电压均为150 V,碰撞能量均
为15 V。
1.3 试验方法
准确称取均质后的样品2.00 g至50 mL具塞离心管内,加入10 mL乙腈,涡旋1 min,超声15 min,10 000 r·min-1离心5 min,取上层清液过 PRiME HLB固相萃取小柱,收集流出液,40 ℃氮吹至近干,1 mL甲醇定容,过0.22 μm有机微孔滤膜,直接注入液相色谱-串联质谱仪,在仪器工作条件下进行测定。
1.4 耐用性实验方案
1.4.1 因素选择
本次试验主要考察10个微小因素(用A~J表示),每个因素设计了两个水平,利用PASW Statistics 18软件设计正交表(表1)。
1.4.2 检测编号组合
将考察的10个因素,按表2的编号组合进行安排。
1.4.3 具体检测方案
按照表2的测试编号组合,共做12次检测。每次检测的条件见表3。
1.4.4 检测分工
实际检测样品是在阴性猪肝中添加固定浓度水平的标准品制得,上机测试液中沙罗拉纳浓度约为100 ng·mL-1(10倍定量限水平)。两个人员的检测分工见表4。
2 结果与分析
2.1 样品预处理条件的选择
2.1.1 超声提取时间
提取环节,试验考察了超声提取10 min、15 min、
20 min 3种情况,考察结果以阴性样品在定量限水平的加标回收率表示,结果见表5。结果表明,超声提取15 min,沙罗拉纳加标回收率最高。
2.1.2 固相萃取小柱选择
针对复杂基质猪肝,前处理净化环节重点考察了固相萃取小柱及提取液,有3种组合形式见表6,考察结果以阴性样品在定量限水平的加标回收率表示,结果见表6。
结果表明,以乙腈作提取液过PRiME HLB小柱,提取净化效果最佳。
2.2 液相色谱条件优化
本文主要考察了3种色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse plus C18、Waters ACQUITY UPLC HSS T3和Waters ACQUITY BEH C18,结果如图1所示。其中,沙罗拉纳采集的两对特征离子对(m/z)为581/416、581/444。流动相体系主要考察了液相色谱-质谱分析中的常见流动相体系,即甲醇-5 mmol·L-1乙酸铵、甲醇-5 mmol·L-1甲酸铵、甲醇-0.1%甲酸水,结果见图2。考察结果表明,3种色谱柱目标物均能实现较好的分离,且峰形较好;3种流动相体系中甲醇-5 mmol·L-1甲酸铵流动相梯度洗脱峰形最佳,分离效果最好。考虑到Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱在实验室中较为常备,液相色谱条件最终选取Agilent ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱、甲醇-5 mmol·L-1甲酸铵流动相梯度洗脱。