核酸适配体在食品兽药残留检测中的应用研究进展

摘 要：食品安全问题是社会最关注的民生问题之一，而食品检测可以为食品安全保驾护航，其中动物性食品中的兽药残留检测是重要的一环。核酸适配体作为一类具有特异识别能力的生物分子，在众多领域得到关注。本文主要总结了核酸适配体在动物性食品兽药残留检测中的应用研究进展，介绍了纳米比色法、荧光分析法、化学发光分析法、电化学传感器检测法以及表面增强拉曼光谱效应等检测方法的机制及应用，并总结了不同方法存在的问题及未来发展趋势，以期为核酸适配体在食品安全检测领域的应用提供参考。

关键词：核酸适配体；兽药残留；动物性食品

Research Progress in the Application of Nucleic Acid Aptamers in the Detection of Veterinary Drug Residues in Food

LI Meifen， YUAN Yue*， MA Rui

（Yunnan Fair Quality Inspection Co.， Ltd.， Kunming 650000， China）

Abstract： Food safety is one of the most concerned livelihood issues in society， and food testing can safeguard food safety. Among them， the detection of veterinary drug residues in animal based foods is an important part. As a class of biomolecules with specific recognition ability， nucleic acid aptamers have received attention in many fields. This paper mainly summarizes the progress of research on the application of nucleic acid aptamers in the detection of veterinary drug residues in animal food. It introduces the mechanisms and applications of detection methods such as nanocolorimetry， fluorescence analysis， chemiluminescence analysis， electrochemical sensor detection， and surface enhanced Raman spectroscopy effect. It also summarizes the problems and future development trends of different methods， to provide reference for application of nucleic acid aptamers in the field of food safety testing.

Keywords： nucleic acid aptamer; veterinary drug residues; animal derived food

随着人们生活水平不断提高，动物性产品的需求量也在不断增加[1]，兽药残留问题也越来越受重视。兽药残留主要包括抗生素类药物残留、激素类药物残留、抗病毒药物残留及抗寄生虫类药物残留等[2]。兽药残留可能引起过敏反应、增加细菌耐药性、扰乱肠道微生物菌群平衡、污染环境，甚至有致突变、致癌和致畸作用[3-5]。因此，必须高度重视动物性食品兽药残留的检测，切实加强食品安全监管。核酸探针法检测兽药残留是一种灵敏、快速、可靠的检测技术，目前已有越来越多的学者致力于该方法的探究。本文对核酸适配体在兽药残留检测中的应用研究进展进行简要介绍，期望为动物性食品兽药残留的监管和检测技术的深入研究提供一定的参考。

1 核酸适配体

核酸适配体（Aptamer，Apt）是一种通过体外配体指数富集系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）从人工构建的寡核苷酸文库中筛选出来的一段长度为20～60 nt的单链寡核苷酸序列[6]。当Apt与靶物质共存时，靶物质能够诱导Apt由自由构象折叠成特有的三维空间结构，如茎环、发夹、G-四链体等[7-9]，并通过碱基对的堆积作用、静电作用[10]、氢键作用[11-12]、范德华力[13]等与靶物质特异性结合[14]，具有亲和力高、特异性强、靶分子范围广、易于制备和修饰、稳定性与可复性好等优势[15-17]。由此，核酸适配体在食品安全控制、分析化学、分子生物学以及环境检测等方面被广泛

应用[18]。

获得亲和性高的单一适配体序列是Apt技术的核心。SELEX技术是目前最常用的Apt筛选手段，通常是从一个1014～1015库容量的随机寡核苷酸文库中筛选与靶物质特异性结合且具有高亲和力的Apt，包括单链DNA文库合成、单链RNA文库制备、孵育、分离、转化、扩增、单链DNA次级文库制备7个步骤，经1～25轮的筛选，即可能得到Apt[19-20]。

2 核酸适配体在食品中兽药残留检测的应用

凭借Apt的优势，其在动物源食品的兽药残留检测发展快速。检测方法主要有纳米比色法、荧光分析法、化学发光分析法、电化学传感器检测法以及表面增强拉曼散射检测法。

2.1 纳米比色法

纳米比色法是基于纳米颗粒表面性质改变后，颜色会发生变化而建立的一种分析方法，主要有纳米金、纳米银等材料[21]。金纳米颗粒（Au Nanoparticles， AuNPs）具有高消光系数和良好的光学效应，近年来在分析检测领域受到相关人员的青睐[22]。纳米金比色法最早由Mirkin等提出，主要分析方法有两类：①基于纳米材料的光学特性显色，依据靶物质触发AuNPs聚集，导致波长红移，可通过紫外可见光谱或肉眼进行测定；②基于酶催化的显色，AuNPs替代有机分子作为模拟酶催化反应中的底物，提高稳定性[23-25]。

张万方等[26]建立了一种纳米金核酸适配体杂交链式反应放大比色法快速检测动物源性食品中氨苄青霉素的残留量，通过Apt与氨苄青霉素结合，引发适配体与发夹型DNA探针的级联交叉互补放大效应，使其与AuNPs表面的负电产生排斥作用，引起AuNPs在高盐浓度下发生聚集，吸收光谱发生红移，该方法最低检测限可达10 nmol·L-1，检测回收率在92.30%～103.27%。钱成等[27]首次利用Apt修饰的AuNPs设计出逻辑开关组，通过Apt、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、三聚氰胺和环丙氨嗪控制AuNPs的聚集和分散，同时快速检测牛奶中的三聚氰胺和环丙氨嗪，三聚氰胺的检出限为85 μg·L-1，

环丙氨嗪的检出限为9.0 μg·L-1。ZHOU等[28]利用Apt与AuNPs结合的比色法测定氟喹诺酮类药物氧氟沙星，线性范围为72.2～144.4 ng·L-1，检出限为1.2 ng·L-1，具有较高的特异性，成本低、操作简单。但由于纳米颗粒的聚集行为容易受温度、盐浓度等的影响，可能出现假阳性，导致检测体系不稳定，而使用模拟酶催化的比色法可以避免这种问题。例如HUANG等[29]将核酸适配体特异性识别结合的特性与DNA zyme功能化纳米探针催化显色原理相结合，建立了一种新型比色生物传感器，并将其用于检测奶粉中氯霉素残留，该实验将过氧化氢酶模拟物及适配体互补探针cDNA与AuNPs结合，构建新的纳米金探针，过氧化氢酶模拟物能催化H2O2，使3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（Tetramethylbenzidine TMB）氧化并产生比色信号，研究发现奶粉样品中加标回收率在92.0%～104.0%，相对标准偏差＜2.7%，检测信号大大增强。赵晨等[30]在采用AuNPs比色法检测水产品中孔雀石绿的研究中，也建立了一种基于十六烷基三甲基溴化铵（Hexadecyl trimethyl ammonium BromideCTAB）抑制AuNPs过氧化物模拟酶活性的可视化检测方法，检测范围在0.01～

2.00 μmol·L-1，检出限为1.8 nmol·L-1；同时以磁性Fe3O4纳米颗粒（Fe3O4NPs）过氧化物模拟酶为催化剂，催化H2O2，氧化TMB显示蓝色，根据DNA适配体对Fe3O4NPs模拟酶催化活性的抑制作用以及靶物质孔雀石绿与DNA适配体结合的特异性，对靶物质的检测范围为0.1～1.0 μmol·L-1，检出限为9.5 nmol·L-1。对比发现，AuNPs模拟酶催化法检出限更低，可用于物质的微量检测。

2.2 荧光分析法

荧光分析法是基于荧光物质在一定的激发波长下能够发射荧光的原理，通过检测荧光强度的变化，对测定物质进行定性或定量分析的一种方法，具有高灵敏度、低背景值和良好选择性等优点，在生命医学、化学、食品安全控制和环境检测等各种检测领域有广泛的应用[31]。Apt本身不产生荧光，需要在反应体系中引入荧光基团、荧光淬灭剂、荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）和荧光内滤效应（Inner Filter Effect，IFE），引起荧光信号强度的变化。荧光基团包括荧光蛋白、荧光燃料、量子点、金属纳米粒子、碳点和纳米材料等具有荧光性能的有机物、无机物和纳米材料。许多纳米材料除了本身有荧光效应，也能作为荧光淬灭剂，还具有吸附单链核酸分子的能力，如氧化石墨烯（Graphene Oxide，GO）、纳米金颗粒、金属纳米颗粒（Metal Nanoparticles，MNPs）、上转换纳米颗粒（Up-Conversion Nanoparticles，UCNPs）、碳纳米管（Carbon Nanotubes，CNTs）、二氧化锰纳米片和各种纳米复合材料等。FRET是当荧光供体和荧光受体的距离足够近时，荧光能量由供体向受体转移的现象[32]。

荧光分析法根据Apt的标记分为标记型检测法和非标记型检测法两类。其中，标记型检测法具有灵敏度高、响应快速、可标记的荧光物质多等优点，具有多重和实时检测能力[33]，尤其引入新型纳米荧光材料时，荧光检测能力大大提升。如ZHANG等[34]用核壳上转换纳米粒子（Core-Shell Upconversion Nanoparticles，CSUNPs）作为荧光供体，GO作为荧光受体，构建了一个基于适配体的CSUNPs-GO荧光共振能量转移平台，以检测食品中恩诺沙星残留量，结果表明，溶液中恩诺沙星检测限为0.47 ng·mL-1，商业奶粉样品中的恩诺沙星检测限为1.59 ng·mL-1。宋亚宁等[35]用溶剂热法合成具有时间分辨特性的荧光纳米材料NaYF 4：Ce/Tb，并基于分子对接辅助设计培氟沙星（Pefloxacin，PEF）适配体的互补链，纳米金与发光纳米材料分别修饰在适配体、互补链上，通过碱基互补配对诱导2种纳米材料间发生时间分辨荧光共振能量转移，构建生物传感PEF的新型检测方法，在最佳条件下，测得牛奶中兽药残留PEF加标回收率为73.81%～99.86%，检测限为0.15 μg·kg-1。LIU等[36]采用UCNPs作为信号源和Apt作为特定识别元件构建了检测恩诺沙星（Enrofloxacin，ENR）的荧光生物传感器，通过形成具有背景荧光信号的双链结构杂交探针（UCNPs-cDNA/Apt-Fe3O4），ENR能够优先与Apt-Fe3O4特异性结合，破坏部分双链结构，释放出UCNPs-cDNA，降低荧光强度，再进行磁分离，检测杂交探针上未释放的UCNPs的荧光强度，最后测得ENR回收率为85.1%～98.5%，检出限为0.06 ng·mL-1，实现了高灵敏度检测。